本文關(guān)鍵詞：組蛋白去乙�；�-2（HDAC2）在慢性應(yīng)激所致認(rèn)知損傷中的作用機制探討

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【摘要】：背景生物有機體長期暴露于內(nèi)源性或外源性的損傷因素刺激下,可通過糖皮質(zhì)激素相關(guān)信號通路的活化,引起認(rèn)知功損傷,甚至可以加重阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease, AD)等疾病的認(rèn)知障礙。表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)尤其是組蛋白乙酰化／去乙�；降恼{(diào)節(jié),為其損傷機制的探討提供了一個新的方向。慢性應(yīng)激可以顯著下調(diào)組蛋白乙酰化水平,抑制功能蛋白的表達(dá),但機制并不清楚。組蛋白去乙酰化酶家族(Histone Deacetylases, HDACs)是催化組蛋白去乙�；年P(guān)鍵酶,某些特定的HDAC成員被研究和發(fā)現(xiàn)參與到學(xué)習(xí)、記憶等相關(guān)認(rèn)知功能活動的調(diào)節(jié)中,如HDAC2。HDAC2屬于HDAC I類家族成員,其異常上調(diào)具有促進(jìn)認(rèn)知損傷的作用,在以認(rèn)知功能障礙為顯著表現(xiàn)的疾病當(dāng)中,HDAC2常有明顯上調(diào)。動物實驗中,HDAC2敲除或抑制都可以顯著改善認(rèn)知功能。慢性應(yīng)激可以下調(diào)組蛋白乙�；�,但是否可以通過以及主要通過某種特定的HDAC家族成員發(fā)揮組蛋白去乙酰化作用,仍然需要進(jìn)一步研究和探討。糖皮質(zhì)激素受體與HDAC2均可表達(dá)于與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬、皮層等腦區(qū),提示兩者之間可能存在功能聯(lián)系。AD模型小鼠中,活化的糖皮質(zhì)激素受體可以結(jié)合在HDAC2蛋白基因啟動子區(qū)域從而使的HDAC2蛋白在海馬區(qū)域含量增加,而應(yīng)激后同樣存在糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)通路的活化,提示HDAC2可能參與到應(yīng)激引起的認(rèn)知功能障礙等過程中。為了探討HDAC2在慢性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷這一過程中的作用,我們將從體外及體內(nèi)兩個方面,應(yīng)用野生(C57BL/6J)及AD模型(APP/PS1)兩種小鼠進(jìn)行相應(yīng)的闡述,旨在探討HDAC2在慢性應(yīng)激下野生小鼠的認(rèn)知損傷以及在AD的疾病進(jìn)展中認(rèn)知功能加重的作用機制。方法體外實驗中,采用小鼠神經(jīng)母細(xì)胞來源的N2a細(xì)胞作為實驗材料,采用corticosteroid(皮質(zhì)酮)作為干預(yù)藥物,選擇corticosteroid (2μM,48h)處理細(xì)胞模擬體外慢性應(yīng)激損傷。觀察藥物干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)、Postsynaptic Density Protein(PSD95)等功能蛋白水平的改變,確定損傷成功。隨后進(jìn)行機制探討,檢測HDAC2蛋白水平、組蛋白乙酰化水平、PI3K/AKT信號通路磷酸化水平的改變。采用HDAC2-shRNA轉(zhuǎn)染沉默進(jìn)行反向驗證,檢測相關(guān)指標(biāo)改善情況,評價HDAC2在corticosteroid損傷N2a細(xì)胞中的作用,為體內(nèi)實驗提供提示。體內(nèi)實驗中,選用野生C57BL/6J小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)AD模型小鼠作為實驗材料,采用慢性束縛性應(yīng)激方式造成慢性應(yīng)激損傷模型。觀察小鼠認(rèn)知相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)改變,檢測小鼠海馬HDAC2蛋白水平的改變及相關(guān)分子指標(biāo)的改變,如突觸可塑性分子：PSD95、Glutamic Acid Receptor-1 (GluR-1)、Synaptophysin (Syn)、GABA Receptor-A Subtype (GABAAR);神經(jīng)營養(yǎng)因子：Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF);立早基因：Arc、Egr; PI3K/AKT信號通路磷酸化水平的改變,探討HDAC2與認(rèn)知損傷的相關(guān)性和可能機制。隨后進(jìn)行野生C57BL/6J野生小鼠HDAC2-shRNA海馬內(nèi)注射,進(jìn)行海馬神經(jīng)元細(xì)胞的HDAC2沉默,檢測小鼠行為學(xué)及相應(yīng)的分子生物學(xué)指標(biāo)是否有改善,評價HDAC2在慢性束縛性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷中的作用。結(jié)果體外實驗中,corticosteroid干預(yù)后可造成N2a細(xì)胞損傷：(1)生長受抑,細(xì)胞平均密度降低,神經(jīng)突樣結(jié)構(gòu)長度顯著縮短；(2)PSD95表達(dá)顯著下降；(3)PI3K/AKT(ser473)磷酸化水平顯著降低。與此同時,N2a細(xì)胞的HDAC2蛋白水平顯著上調(diào),并伴隨組蛋白H3K9位點的乙�；斤@著下調(diào)。HDAC2沉默后,可以部分改善上述的細(xì)胞損傷：(1)形態(tài)學(xué)的部分恢復(fù)；(2)PSD95的部分回升；(3)PI3K/AKT(ser473)磷酸化水平的改善。體內(nèi)實驗中,慢性束縛性應(yīng)激可明顯損傷兩種小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,顯著升高海馬區(qū)HDAC2的蛋白水平。野生C57BL/6J小鼠應(yīng)激后,認(rèn)知相關(guān)分子指標(biāo)顯著下降,如PSD95、GIuR-1、BDNF、Egr、AKT (ser473)磷酸化水平等；海馬HDAC2沉默后,可顯著改善其學(xué)習(xí)記憶能力,在一定程度上抵御了慢性應(yīng)激下的認(rèn)知損傷。結(jié)論本實驗研究發(fā)現(xiàn)：HDAC2在慢性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷中上調(diào),并起到損傷作用。結(jié)果提示：(1)HDAC2在慢性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷中上調(diào),并起到損傷作用；(2)HDAC2沉默具有神經(jīng)保護(hù)作用,可以在一定程度上抵抗慢性應(yīng)激所致的認(rèn)知功能損傷；(3)不同的年齡階段對于應(yīng)激損傷的抵抗能力不同,年老階段對于應(yīng)激損傷的抵抗能力顯著下降,即更容易受到慢性應(yīng)激的損傷,HDAC2可能是一個增加應(yīng)激損傷敏感性的協(xié)同因素；(4)在某些以認(rèn)知功能損傷為主要表現(xiàn)的疾病,如AD中,HDAC2的蛋白水平顯著升高,但其上調(diào)的原因并不清楚,本實驗結(jié)果提示慢性應(yīng)激可能是相關(guān)疾病中HDAC2上調(diào)的原因之一,進(jìn)一步探討其中的調(diào)控機制,有助于疾病發(fā)病機制的深入和新的HDAC2抑制靶點發(fā)現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：慢性應(yīng)激 組蛋白去乙酰化酶-2(HDAC2) 認(rèn)知功能 阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease AD) 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-14
• 第一部分 組蛋白去乙�；�-2 (HDAC2)在慢性應(yīng)激所致的C57BL/6J小鼠認(rèn)知損傷中的作用機制探討14-94
• (一) HDAC2介導(dǎo)應(yīng)激素Corticosteroid誘發(fā)的Neuro-2a細(xì)胞的功能損傷15-46
• 材料和方法15-29
• 一、材料15-22
• 1. 實驗細(xì)胞15
• 2. 主要試劑及耗材15-17
• 3. 主要抗體來源及濃度17-18
• 4. 主要試劑配制方法18-21
• 5. 主要儀器設(shè)備21-22
• 二、方法22-28
• 1. 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.藥物配制22-23
• 3. MTT方法選取最佳藥物干預(yù)濃度23
• 4. N2a 細(xì)胞 HDAC2-shRNA 沉默23-25
• 5. N2a細(xì)胞藥物干預(yù)25
• 6. N2a細(xì)胞總蛋白提取25-26
• 7. BCA~（Tm） Protein Assay Kit 測總蛋白濃度26
• 8. SDS-PAGE 凝膠電泳及 Western Blot26-28
• 9. 細(xì)胞免疫熒光28
• 三、統(tǒng)計學(xué)方法28-29
• 結(jié)果29-43
• 1. Corticosteroid 損傷 N2a 細(xì)胞活性29-30
• 2. Corticosteroid損傷N2a細(xì)胞的形態(tài)30-31
• 3. Corticosteroid損傷N2a細(xì)施的功能31-32
• 4. Corticosteroid干預(yù)后上調(diào)了 HDAC2蛋白水平，同時下調(diào)了組蛋白H3K9的乙�；�32-35
• 5. LV-shRJVA-mHdac2 有效性檢測35-38
• 6. HDAC2沉默改善N2a細(xì)胞病理學(xué)損傷38-39
• 7. HDAC2沉默改善了 N2a細(xì)胞功能的機制探討39-43
• 討論43-45
• 小結(jié)45-46
• (二) 組蛋白去乙�；�-2（HDAC2）參與到慢性束縛性應(yīng)激所致的老年C57BL/6J小鼠的認(rèn)知損傷中46-79
• 材料和方法46-61
• 一、材料46-53
• 1.實驗動物46
• 2.主要試劑及耗材46-48
• 3.主要抗體來源及濃度48-49
• 4.主要設(shè)計配制方法49-52
• 5. 主要儀器設(shè)備52-53
• 二、方法53-60
• 1. 實驗動物53
• 2. 慢性束縛性應(yīng)激53-54
• 3. 行為學(xué)實驗54-57
• 4.化組織蛋白提取57
• 5. BCA~(TM) Pro化in Assay Kit測總蛋芭濃度57-58
• 6. SDS-PAGE 凝膠電泳及 Western Blot58-59
• 7.血清 corticosteroid 水平檢測59-60
• 8.免疫熒光染色60
• 三、統(tǒng)計學(xué)方法60-61
• 結(jié)果61-76
• 一. 慢性束縛性應(yīng)激對小鼠行為學(xué)的影響61-67
• 二. 慢性束縛性應(yīng)激后小鼠的形態(tài)學(xué)改變67-68
• 三、慢性束縛性應(yīng)激后小鼠的血皮質(zhì)酮升高68-69
• 四、慢性應(yīng)激上調(diào)海馬HDAC2蛋白水平69-72
• 五、慢性應(yīng)激下調(diào)海馬組蛋白乙�；�72
• 六、慢性應(yīng)激下海馬區(qū)影響突觸可塑性的相關(guān)分子蛋自表達(dá)改變72-74
• 七、慢性應(yīng)激下海馬區(qū)立早基因水平的改變74
• 八、下調(diào)的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF74-76
• 討論76-78
• 小結(jié)78-79
• (三) C57BL/6J小鼠海馬區(qū)HDAC2沉默后認(rèn)知功能的改變79-94
• 材料和方法79-83
• 一、材料79-80
• 1.實驗動物79
• 2.主要試劑及耗材79
• 3.主要抗體來源及濃度79-80
• 4.主要試劑及配置方法見（二）部分80
• 5.主要儀器設(shè)備80
• 二、方法80-81
• 1. 實驗動物80
• 2. 海馬區(qū)shRNA注射80-81
• 3. 慢性束縛性應(yīng)激81
• 4. 行為學(xué)實驗81
• 5. 腦組織蛋白提取，，詳見（二）部分81
• 6. BCA~（TM） Protein Assay Kit測總蛋白濃度，詳見（二）部分81
• 7. SDS-PAGE凝膠電泳及Western Blot,詳見（二）部分81
• 8.免疫熒光染色詳見（二）部分81
• 三、統(tǒng)計學(xué)方法81-83
• 結(jié)果83-91
• —、海馬HDAC2-shRNA干預(yù)后可顯著降低海馬HDAC2的蛋白水平83-84
• 二、HDAC2-shRNA干預(yù)后可部分改善小鼠的行為表現(xiàn)84-87
• 三. 相關(guān)分子改變機制87-89
• 四、HDAC2-shRNA海馬區(qū)注射并未顯著改善應(yīng)激后小鼠的認(rèn)知功能89-91
• 討論91-93
• 小結(jié)93-94
• 第二部分 HDAC2加速慢性應(yīng)激下APP/PS1雙轉(zhuǎn)AD模型小鼠的認(rèn)知功能損傷94-105
• 材料和方法95-99
• 結(jié)果99-103
• 一. APP/PS1的鑒定99
• 二、免疫組化染色顯示APP/PSl小鼠腦郁老年斑形成99-100
• 三、Morris水謎[形Ц謀
  
  本文編號：972852
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