本文關鍵詞：Aβ引起神經干細胞衰老及降低煙堿類似物ZY-1治療的反應性

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征是：細胞內外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)的沉積和細胞內tau蛋白的高度磷酸化以及神經元的丟失。成年海馬神經再生障礙與AD記憶力下降有著密切的關系。目前，用于AD治療的膽堿酯酶抑制劑和非競爭性NMDA受體抑制劑臨床療效不佳。因此，新型藥物研發(fā)需要考慮其對AD成年海馬神經再生的影響。 已經取得專利的煙堿類似物ZY-1對α4β2亞型煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)具有高度的親和力，前期研究表明，該化合物能夠抑制體外特定轉染α4β2nAChR細胞產生的Aβ，并且顯著改善9月齡APP/PS1轉基因AD模型小鼠的空間學習記憶能力。為了進一步探討ZY-1是否具有可以作為AD治療藥物研發(fā)的潛力，我們應用細胞生物學和分子生物學等方法，研究ZY-1對成年小鼠海馬神經再生的影響，并分析其可能的機制。 體外成功分離、培養(yǎng)成年小鼠海馬神經干細胞(neural stem/progenitorcells, NSPCs)。不同濃度的ZY-1處理NSPCs7天后，CCK8實驗檢測ZY-1對NSPCs活力的影響，結果表明，ZY-1在0.1~5μM范圍內明顯增加了細胞活力，并且在1μM濃度下達到最大效應，此效應可被α4β2nAChR拮抗劑DHβE所抑制。神經球增殖實驗檢測ZY-1對NSPCs增殖的影響，結果顯示，ZY-1增加了神經球的數目和神經球的大小，表明ZY-1促進了NSPCs的增殖能力。劃痕損傷實驗和Transwell遷移實驗檢測ZY-1對NSPCs遷移能力的影響，結果均顯示，ZY-1明顯促進NSPCs的遷移能力。細胞免疫熒光實驗和蛋白質免疫印跡實驗檢測ZY-1對NSPCs分化能力的影響，結果表明，ZY-1對NSPCs向神經元或星形膠質細胞的分化能力均無影響。對其機制的探索，發(fā)現(xiàn)在NSPCs增殖期間ZY-1明顯增加細胞內ROS水平，，同時還能抑制Aβ42誘導的細胞內ROS水平。這些結果說明，在體外，ZY-1通過調節(jié)細胞內ROS水平促進成年海馬神經再生。 前期體內實驗表明，對APP/PS1轉基因AD模型小鼠的Aβ沉積和神經元受損等病理特征，ZY-1療效不佳。在此基礎上，我們用β-III-tubulin標記新生的神經元，免疫熒光實驗觀察到，AD小鼠腦內海馬齒狀回(dentategyrus, DG)區(qū)新生神經元數目明顯減少，但是ZY-1對這種新生神經元的減少的現(xiàn)象也無明顯改善作用。 為了分析ZY-1改善AD腦內神經再生障礙失敗的原因，我們又進一步研究了AD腦內局部不良微環(huán)境對NSPCs的影響，并探索其可能的作用機制。 寡聚體Aβ42(2.5μM~10μM)處理NSPCs1天、3天和5天后，CCK-8實驗表明，Aβ42呈濃度依賴性和時間依賴性的抑制細胞活力，并且Aβ42處理的神經球數目和大小也明顯減少。在細胞形態(tài)方面，無論懸浮培養(yǎng)還是單層貼壁培養(yǎng)的Aβ42處理的NSPCs均顯示了細胞衰老的形態(tài)。細胞免疫熒光實驗和蛋白質免疫印跡實驗均顯示，Aβ42明顯抑制了NSPCs向神經元和星形膠質細胞的分化能力。此外，Aβ42還增加了NSPCs中細胞衰老的數目以及與衰老有關的p16蛋白的表達，并降低其下游分子Rb蛋白的磷酸化水平。這些結果均表明，Aβ42加速了NSPCs的衰老。 體內實驗顯示，與野生型相比，Aβ特異性的存在于APP/PS1轉基因小鼠的皮質和海馬中。在APP/PS1轉基因小鼠海馬DG區(qū)中，隨著Aβ的逐漸沉積，NSPCs數目明顯減少，至18月齡幾乎消失；與同齡野生型相比，9月齡APP/PS1轉基因小鼠海馬DG區(qū)衰老的NSPCs數目明顯增加，同時，用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測衰老細胞分泌的蛋白，發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠海馬組織中分泌的細胞因子IL-6明顯增加，IGF-1水平降低。這些體內實驗進一步表明，Aβ與NSPCs的衰老有關。 為了明確Aβ42誘導NSPCs衰老的機制，我們發(fā)現(xiàn)小鼠海馬DG區(qū)以及體外培養(yǎng)的NSPCs中均存在Aβ42功能性甲酰肽受體2(formylpeptidereceptor2, FPR2)的表達。Aβ42誘導NSPCs中FPR2蛋白表達增高，其抑制劑WRW4能顯著改善Aβ42誘導的NSPCs衰老表型。此外，Aβ42還增加了細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及p38蛋白的磷酸化水平，WRW4、抗氧化劑NAC或p38MAPK抑制劑SB203580均抑制了Aβ42誘導的氧應激及NSPCs的衰老。這些結果表明，Aβ42通過功能性FPR2受體及其下游ROS-p38MAPK信號通路加速了NSPCs的衰老。 綜上所述，ZY-1在體外通過調控細胞內ROS水平促進成年海馬神經再生，然而，對APP/PS1轉基因小鼠AD模型的病理特征和神經再生障礙均無改善作用。對其原因分析，我們發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠海馬中Aβ的存在通過功能性FPR2受體及其下游ROS-p38MAPK信號通路加速了NSPCs的衰老，限制了NSPCs的功能，并最終導致神經再生障礙。 這些結果提示，神經再生對腦內局部不良微環(huán)境更為敏感，在神經再生失敗的基礎上刺激NSPCs增殖，療效不佳，并可能影響藥物改善學習記憶長期療效的穩(wěn)定性。治療AD的藥物研發(fā)應考慮腦內局部不良微環(huán)境對神經再生的影響。
【關鍵詞】：阿爾茨海默病 煙堿類似物ZY-1 成年海馬神經干細胞 β-淀粉樣蛋白42 衰老
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要9-13
• ABSTRACT13-18
• 前言18-31
• 1.1 阿爾茨海默病18
• 1.2 AD 藥物研發(fā)的新進展18-20
• 1.3 成年神經再生20-23
• 1.4 AD 腦中的成年神經再生23-26
• 1.5 影響成年神經再生的因素26-28
• 1.6 目前臨床治療 AD 的藥物與神經再生的關系28-29
• 1.7 本研究內容和意義29-31
• 材料與方法31-52
• 2.1 實驗材料31-36
• 2.1.1 實驗動物31
• 2.1.2 主要藥品和試劑31-33
• 2.1.3 主要儀器設備33-34
• 2.1.4 主要試藥與試劑的配制34-36
• 2.2 實驗方法36-52
• 2.2.1 成年小鼠海馬 NSPCs 培養(yǎng)36-39
• 2.2.2 寡聚體 Aβ42制備39-40
• 2.2.3 NSPCs 活力、增殖、遷移和分化的檢測40-42
• 2.2.4 病理學檢測42-45
• 2.2.5 老化指標檢測45-49
• 2.2.6 蛋白質免疫印跡實驗(western blot)檢測各蛋白的表達水平49-51
• 2.2.7 統(tǒng)計學分析51-52
• 結果52-85
• 3.1 成年小鼠海馬 NSPCS 的培養(yǎng)52-55
• 3.2 煙堿類似物 ZY-1 對成年海馬神經再生的影響55-65
• 3.3 AΒ_(42)對成年海馬 NSPCS 的影響及機制研究65-85
• 討論85-94
• 4.1 成年小鼠海馬 NSPCS 的培養(yǎng)85-87
• 4.2 煙堿類似物 ZY-1 對成年海馬神經再生的影響87-90
• 4.3 AΒ_(42)對成年海馬 NSPCS 的影響及機制研究90-94
• 全文總結94-96
• 5.1 主要結果94-95
• 5.2 本實驗的創(chuàng)新點95
• 5.3 研究展望95-96
• 參考文獻96-103
• 縮寫詞表103-105
• 攻讀博士學位期間參與的科研項目105-106
• 攻讀博士學位期間已發(fā)表或錄用的論文和獲獎情況106-108
• 致謝108-109

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 田金洲;時晶;張學凱;倪敬年;張伯禮;王永炎;;2011年美國阿爾茨海默病最新診斷標準解讀[J];中國醫(yī)學前沿雜志(電子版);2011年04期

2 段建輝;祝曉玲;李學軍;;神經干細胞衰老基礎與臨床研究進展[J];國際病理科學與臨床雜志;2011年04期

本文編號：966911