發(fā)布時(shí)間：2017-10-03 21:36

  本文關(guān)鍵詞：Aβ引起神經(jīng)干細(xì)胞衰老及降低煙堿類似物ZY-1治療的反應(yīng)性

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理特征是：細(xì)胞內(nèi)外β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ)的沉積和細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的高度磷酸化以及神經(jīng)元的丟失。成年海馬神經(jīng)再生障礙與AD記憶力下降有著密切的關(guān)系。目前，用于AD治療的膽堿酯酶抑制劑和非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體抑制劑臨床療效不佳。因此，新型藥物研發(fā)需要考慮其對(duì)AD成年海馬神經(jīng)再生的影響。 已經(jīng)取得專利的煙堿類似物ZY-1對(duì)α4β2亞型煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)具有高度的親和力，前期研究表明，該化合物能夠抑制體外特定轉(zhuǎn)染α4β2nAChR細(xì)胞產(chǎn)生的Aβ，并且顯著改善9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。為了進(jìn)一步探討ZY-1是否具有可以作為AD治療藥物研發(fā)的潛力，我們應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等方法，研究ZY-1對(duì)成年小鼠海馬神經(jīng)再生的影響，并分析其可能的機(jī)制。 體外成功分離、培養(yǎng)成年小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem/progenitorcells, NSPCs)。不同濃度的ZY-1處理NSPCs7天后，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZY-1對(duì)NSPCs活力的影響，結(jié)果表明，ZY-1在0.1~5μM范圍內(nèi)明顯增加了細(xì)胞活力，并且在1μM濃度下達(dá)到最大效應(yīng)，此效應(yīng)可被α4β2nAChR拮抗劑DHβE所抑制。神經(jīng)球增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZY-1對(duì)NSPCs增殖的影響，結(jié)果顯示，ZY-1增加了神經(jīng)球的數(shù)目和神經(jīng)球的大小，表明ZY-1促進(jìn)了NSPCs的增殖能力。劃痕損傷實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZY-1對(duì)NSPCs遷移能力的影響，結(jié)果均顯示，ZY-1明顯促進(jìn)NSPCs的遷移能力。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZY-1對(duì)NSPCs分化能力的影響，結(jié)果表明，ZY-1對(duì)NSPCs向神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化能力均無影響。對(duì)其機(jī)制的探索，發(fā)現(xiàn)在NSPCs增殖期間ZY-1明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，，同時(shí)還能抑制Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平。這些結(jié)果說明，在體外，ZY-1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平促進(jìn)成年海馬神經(jīng)再生。 前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的Aβ沉積和神經(jīng)元受損等病理特征，ZY-1療效不佳。在此基礎(chǔ)上，我們用β-III-tubulin標(biāo)記新生的神經(jīng)元，免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到，AD小鼠腦內(nèi)海馬齒狀回(dentategyrus, DG)區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，但是ZY-1對(duì)這種新生神經(jīng)元的減少的現(xiàn)象也無明顯改善作用。 為了分析ZY-1改善AD腦內(nèi)神經(jīng)再生障礙失敗的原因，我們又進(jìn)一步研究了AD腦內(nèi)局部不良微環(huán)境對(duì)NSPCs的影響，并探索其可能的作用機(jī)制。 寡聚體Aβ42(2.5μM~10μM)處理NSPCs1天、3天和5天后，CCK-8實(shí)驗(yàn)表明，Aβ42呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性的抑制細(xì)胞活力，并且Aβ42處理的神經(jīng)球數(shù)目和大小也明顯減少。在細(xì)胞形態(tài)方面，無論懸浮培養(yǎng)還是單層貼壁培養(yǎng)的Aβ42處理的NSPCs均顯示了細(xì)胞衰老的形態(tài)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)均顯示，Aβ42明顯抑制了NSPCs向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化能力。此外，Aβ42還增加了NSPCs中細(xì)胞衰老的數(shù)目以及與衰老有關(guān)的p16蛋白的表達(dá)，并降低其下游分子Rb蛋白的磷酸化水平。這些結(jié)果均表明，Aβ42加速了NSPCs的衰老。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型相比，Aβ特異性的存在于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)和海馬中。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)中，隨著Aβ的逐漸沉積，NSPCs數(shù)目明顯減少，至18月齡幾乎消失；與同齡野生型相比，9月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬DG區(qū)衰老的NSPCs數(shù)目明顯增加，同時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)衰老細(xì)胞分泌的蛋白，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中分泌的細(xì)胞因子IL-6明顯增加，IGF-1水平降低。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，Aβ與NSPCs的衰老有關(guān)。 為了明確Aβ42誘導(dǎo)NSPCs衰老的機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)小鼠海馬DG區(qū)以及體外培養(yǎng)的NSPCs中均存在Aβ42功能性甲酰肽受體2(formylpeptidereceptor2, FPR2)的表達(dá)。Aβ42誘導(dǎo)NSPCs中FPR2蛋白表達(dá)增高，其抑制劑WRW4能顯著改善Aβ42誘導(dǎo)的NSPCs衰老表型。此外，Aβ42還增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)以及p38蛋白的磷酸化水平，WRW4、抗氧化劑NAC或p38MAPK抑制劑SB203580均抑制了Aβ42誘導(dǎo)的氧應(yīng)激及NSPCs的衰老。這些結(jié)果表明，Aβ42通過功能性FPR2受體及其下游ROS-p38MAPK信號(hào)通路加速了NSPCs的衰老。 綜上所述，ZY-1在體外通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平促進(jìn)成年海馬神經(jīng)再生，然而，對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型的病理特征和神經(jīng)再生障礙均無改善作用。對(duì)其原因分析，我們發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠海馬中Aβ的存在通過功能性FPR2受體及其下游ROS-p38MAPK信號(hào)通路加速了NSPCs的衰老，限制了NSPCs的功能，并最終導(dǎo)致神經(jīng)再生障礙。 這些結(jié)果提示，神經(jīng)再生對(duì)腦內(nèi)局部不良微環(huán)境更為敏感，在神經(jīng)再生失敗的基礎(chǔ)上刺激NSPCs增殖，療效不佳，并可能影響藥物改善學(xué)習(xí)記憶長(zhǎng)期療效的穩(wěn)定性。治療AD的藥物研發(fā)應(yīng)考慮腦內(nèi)局部不良微環(huán)境對(duì)神經(jīng)再生的影響。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 煙堿類似物ZY-1 成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞 β-淀粉樣蛋白42 衰老
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要9-13
• ABSTRACT13-18
• 前言18-31
• 1.1 阿爾茨海默病18
• 1.2 AD 藥物研發(fā)的新進(jìn)展18-20
• 1.3 成年神經(jīng)再生20-23
• 1.4 AD 腦中的成年神經(jīng)再生23-26
• 1.5 影響成年神經(jīng)再生的因素26-28
• 1.6 目前臨床治療 AD 的藥物與神經(jīng)再生的關(guān)系28-29
• 1.7 本研究?jī)?nèi)容和意義29-31
• 材料與方法31-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料31-36
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物31
• 2.1.2 主要藥品和試劑31-33
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備33-34
• 2.1.4 主要試藥與試劑的配制34-36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-52
• 2.2.1 成年小鼠海馬 NSPCs 培養(yǎng)36-39
• 2.2.2 寡聚體 Aβ42制備39-40
• 2.2.3 NSPCs 活力、增殖、遷移和分化的檢測(cè)40-42
• 2.2.4 病理學(xué)檢測(cè)42-45
• 2.2.5 老化指標(biāo)檢測(cè)45-49
• 2.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)檢測(cè)各蛋白的表達(dá)水平49-51
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析51-52
• 結(jié)果52-85
• 3.1 成年小鼠海馬 NSPCS 的培養(yǎng)52-55
• 3.2 煙堿類似物 ZY-1 對(duì)成年海馬神經(jīng)再生的影響55-65
• 3.3 AΒ_(42)對(duì)成年海馬 NSPCS 的影響及機(jī)制研究65-85
• 討論85-94
• 4.1 成年小鼠海馬 NSPCS 的培養(yǎng)85-87
• 4.2 煙堿類似物 ZY-1 對(duì)成年海馬神經(jīng)再生的影響87-90
• 4.3 AΒ_(42)對(duì)成年海馬 NSPCS 的影響及機(jī)制研究90-94
• 全文總結(jié)94-96
• 5.1 主要結(jié)果94-95
• 5.2 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)95
• 5.3 研究展望95-96
• 參考文獻(xiàn)96-103
• 縮寫詞表103-105
• 攻讀博士學(xué)位期間參與的科研項(xiàng)目105-106
• 攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的論文和獲獎(jiǎng)情況106-108
• 致謝108-109

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 田金洲;時(shí)晶;張學(xué)凱;倪敬年;張伯禮;王永炎;;2011年美國(guó)阿爾茨海默病最新診斷標(biāo)準(zhǔn)解讀[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2011年04期

2 段建輝;祝曉玲;李學(xué)軍;;神經(jīng)干細(xì)胞衰老基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展[J];國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志;2011年04期

本文編號(hào)：966911