本文關(guān)鍵詞：家蠶表達的霍亂病毒B亞基融合蛋白防治1型糖尿病和阿爾茨海默癥研究

  更多相關(guān)文章： 1型糖尿病 霍亂毒素B亞基 胰島素 谷氨酸脫羧酶65 口服耐受 阿爾茨海默癥 β樣淀粉蛋白 免疫療法

【摘要】：1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)和阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)是威脅人類健康的兩大疾病,二者之間存在著密切的聯(lián)系。免疫療法已被證明是一條有潛在應用前景的防治T1D和AD有效方法。第一部分口服家蠶表達的胰島素和谷氨酸脫羧酶65雙抗原防治1型糖尿病研究1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)是一種由T細胞介導胰島p細胞損傷的自身免疫性疫病。通過口服自身抗原誘導粘膜免疫耐受是預防和治療T1D的有效方法。然而誘導口服耐受需要大量抗原,而且功效很低,這就限制了口服耐受在臨床上的應用。在本研究中,我們設計了包含胰島素,三拷貝的谷氨酸脫羧酶65 p531-545多肽和霍亂病毒B亞基融合蛋白(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins),通過家蠶生物反應器高效表達了該融合蛋白,并評價該融合蛋白對T1D的保護作用。我們的研究結(jié)果表明口服CTB-Ins-GAD可以抑制78%T1D,比單獨口服胰島素或者GAD65更有效�？诜﨏TB-Ins-GAD可以誘導胰島素和GAD65特異性的Th2型的免疫反應,更有利于修復Thl/Th2免疫失衡,另外,CTB-Ins-GAD可以誘導更多的CD4~+CD25~+Foxp3~+調(diào)節(jié)性T細胞來抑制胰島素和GAD65反應性T細胞的增殖和遷移。我們的研究結(jié)果表明聯(lián)合雙抗原結(jié)合家蠶生物反應器能促進口服耐受的誘導,因此,為T1D的治療提供了一條經(jīng)濟有效的免疫療法。第二部分口服家蠶表達的霍亂毒素B亞基與雙重Aβ42融合蛋白防治阿爾茨海默癥研究阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease, AD)的主要病理學特征包括腦中神經(jīng)細胞外β-淀粉樣多肽沉積形成的老年斑,細胞內(nèi)過度磷酸化Tau蛋白導致的神經(jīng)纖維纏結(jié)。Aβ是老年斑的主要成分,腦內(nèi)出現(xiàn)病理性的Ap沉積是患AD的標志。主動或者被動免疫清除Aβ是目前被廣泛研究的有很大潛力的治療AD的方法。然而,用Aβ主動或者被動免疫提高了患腦膜炎或者引起腦出血的風險。在本研究中,我們通過家蠶生物感應器高效表達了包含霍亂病毒B亞基和兩個拷貝的Aβ42的融合蛋白(CTB-(Aβ42)2),并評價了該融合蛋白對AD的保護作用。我們的研究結(jié)果表明口服CTB-(Aβ42)2誘導非致炎的Aβ42特異性的Th2型免疫反應,顯著地降低了Aβ水平,老年斑面積和Tau蛋白的磷酸化水平,改善AD小鼠的記憶和認知功能,但是沒有引起IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10等細胞因子水平的變化。我們的研究認為CTB-(Aβ42)_2對AD有治療作用,為AD的治療提供了一條經(jīng)濟有效的免疫療法。
【關(guān)鍵詞】：1型糖尿病 霍亂毒素B亞基 胰島素 谷氨酸脫羧酶65 口服耐受 阿爾茨海默癥 β樣淀粉蛋白 免疫療法
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R749.16
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮寫表11-17
• 第一部分 口服家蠶表達的胰島素和谷氨酸脫羧酶65雙抗原防治1型糖尿病研究17-67
• 1 引言17-21
• 1.1 1型糖尿病17-18
• 1.2 口服耐受18-19
• 1.3 聯(lián)合免疫療法19
• 1.4 本研究的目的與意義19-21
• 2 實驗材料與方法21-40
• 2.1 實驗材料21-25
• 2.1.1 實驗動物21
• 2.1.2 細胞系21
• 2.1.3 質(zhì)粒和細菌21
• 2.1.4 抗體21
• 2.1.5 實驗耗材與設備21-22
• 2.1.6 實驗試劑22
• 2.1.7 相關(guān)試劑配置22-25
• 2.2 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins桿狀病毒的構(gòu)建實驗方法25-33
• 2.2.1 CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins融合基因的構(gòu)建25-28
• 2.2.2 PCR產(chǎn)物凝膠回收28
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物連接PMD19-T載體28
• 2.2.4 E.coli TG1感受態(tài)細胞的制備28-29
• 2.2.5 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(TG1或DH10)29
• 2.2.6 陽性克隆的擴大培養(yǎng)及質(zhì)粒抽提29
• 2.2.7 陽性質(zhì)粒的酶切鑒定29-30
• 2.2.8 重組桿狀病毒質(zhì)粒(Bacmid)構(gòu)建30-31
• 2.2.9 桿狀病毒的獲得與鑒定31-33
• 2.2.9.1 家蠶卵巢細胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.9.2 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的獲得32
• 2.2.9.3 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)的擴大培養(yǎng)32-33
• 2.2.9.4 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)感染能力測定33
• 2.2.9.5 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)基因組提取33
• 2.2.9.6 桿狀病毒(CTB-Ins-GAD/CTB-GAD-Ins)PCR鑒定33
• 2.3 融合蛋白的表達實驗方法33-36
• 2.3.1 融合蛋白在家蠶卵巢細胞中的表達33-34
• 2.3.2 融合蛋白在蠶蛹中的表達34
• 2.3.3 Western blot實驗方法34-35
• 2.3.4 ELlSA法測定表達量35-36
• 2.3.5 GM1-ELISA測定融合蛋白的GM1結(jié)合力36
• 2.4 口服融合蛋白防治T1D實驗方法36-40
• 2.4.1 抗體及抗體亞型滴度檢測36-37
• 2.4.2 胰腺組織切片37
• 2.4.3 口服CTB-Ins-GAD和CTB-GAD-Ins防治T1D效果檢測37
• 2.4.4 Th1/Th2細胞ELISPOT分析37-38
• 2.4.5 IL-4/IFN-γ細胞因子濃度檢測38
• 2.4.6 CD4+CD25+Foxp3+T細胞分析38
• 2.4.7 脾臟淋巴細胞體外增值能力分析38-39
• 2.4.8 脾臟淋巴細胞體外遷移能力分析39
• 2.4.9 過繼轉(zhuǎn)移實驗方法39-40
• 3 實驗結(jié)果與分析40-64
• 3.1 獲得CTB-GAD、CTB-Ins、GAD、Ins片段40
• 3.2 構(gòu)建CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD融合基因40-41
• 3.3 構(gòu)建Bacmid(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)載體41-45
• 3.3.1 pBac(CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD)載體構(gòu)建和鑒定41-42
• 3.3.2 重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定42-43
• 3.3.3 重組桿狀病毒的獲得及鑒定43-44
• 3.3.4 BmV-CTB-GAD-Ins和BmV-CTB-Ins-GAD病毒滴度檢測44-45
• 3.4 融合蛋白的表達及鑒定45-48
• 3.4.1 融合蛋白在家蠶細胞和蠶蛹高效表達45-46
• 3.4.2 Western Blot分析融合蛋白表達46-47
• 3.4.3 GM1結(jié)合ELISA檢測蛋白活性47-48
• 3.5 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD減輕胰島炎48-50
• 3.6 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD降低糖尿病發(fā)病率50-51
• 3.7 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導胰島素和GAD特異性的Th2型免疫反應51-53
• 3.8 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導Th1向Th2型轉(zhuǎn)化53-56
• 3.9 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD增加調(diào)節(jié)性T細胞分化56-58
• 3.10 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾臟T細胞增殖58-60
• 3.11 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD抑制脾臟T細胞遷移60-62
• 3.12 口服CTB-GAD-Ins/CTB-Ins-GAD誘導NOD小鼠產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞62-64
• 4 討論64-67
• 第二部分 口服家蠶表達的霍亂病毒B亞基與雙拷貝Aβ42融合蛋白防治阿爾茨海默癥研究67-99
• 1 引言67-71
• 1.1 阿爾茨海默癥67
• 1.2 阿爾茨海默癥的治療67-69
• 1.2.1 傳統(tǒng)療法67-68
• 1.2.2 免疫療法68-69
• 1.3 本研究的目的意義69-71
• 2 實驗材料與方法71-76
• 2.1 實驗材料71-72
• 2.1.1 實驗動物71
• 2.1.2 細胞系71
• 2.1.3 質(zhì)粒和細菌71
• 2.1.4 抗體71
• 2.1.5 實驗耗材與設備71
• 2.1.6 實驗試劑71-72
• 2.1.7 相關(guān)試劑配置72
• 2.2 重組病毒的構(gòu)建和鑒定實驗方法72
• 2.2.1 融合基因的構(gòu)建72
• 2.3 融合蛋白的表達與鑒定72
• 2.4 血清特異性抗體及抗體亞型的滴度檢測72
• 2.5 AD小鼠行為學檢測實驗方法72-74
• 2.5.1 水迷宮檢測72-73
• 2.5.2 曠場實驗73
• 2.5.3 Y-迷宮實驗73-74
• 2.6 小鼠腦中Aβ含量的檢測74
• 2.7 小鼠大腦老年斑塊的形態(tài)學檢測74-75
• 2.8 小鼠腦中細胞因子濃度的檢測75-76
• 3 實驗結(jié)果與分析76-97
• 3.1 構(gòu)建CTB-(Aβ42)_2融合基因76
• 3.2 構(gòu)建包含CTB-(Aβ42)_2融合基因的Bacmid載體76-79
• 3.2.1 pFastBacl載體構(gòu)建與鑒定76-77
• 3.2.2 重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定77
• 3.2.3 重組桿狀病毒的獲得及鑒定77-79
• 3.2.4 BmNPV-CTB-(Aβ42)_2病毒滴度檢測79
• 3.3 重組融合蛋白的表達及鑒定79-82
• 3.3.1 重組融合蛋白在家蠶細胞和蠶蛹高效表達79-80
• 3.3.2 Western Blot分析融合蛋白表達80-81
• 3.3.3 GM1結(jié)合ELISA檢測蛋白活性81-82
• 3.4 AD小鼠血清抗體滴度檢測82-83
• 3.5 AD小鼠行為學檢測83-90
• 3.5.1 Morris水迷宮實驗83-87
• 3.5.2 曠場實驗87-88
• 3.5.3 Y-迷宮實驗88-90
• 3.6 口服CTB-(Aβ42)_2減少小鼠血清和腦組織Aβ水平檢測90-91
• 3.7 口服CTB-(Aβ42)_2減少AD小鼠大腦皮層和海馬區(qū)老年斑面積91-92
• 3.8 小鼠腦組織細胞因子檢測92-93
• 3.9 口服CTB-(Aβ42)_2改善AD小鼠PI3K/AKT信號通路93-94
• 3.10 口服CTB-(Aβ42)_2降低小鼠Tau蛋白磷酸化水平94-97
• 4 討論97-99
• 結(jié)論與展望99-100
• 參考文獻100-112
• 作者簡歷112

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