本文關(guān)鍵詞：發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙PRRT2突變特征，基因型表型關(guān)系及可能機(jī)制

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【摘要】：發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(paroxysmal kinesigenic dyskinesia, PKD)是發(fā)作性運(yùn)動(dòng)障礙中最常見的一種,臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作,運(yùn)動(dòng)誘發(fā),持續(xù)時(shí)間短暫的非隨意運(yùn)動(dòng),如舞蹈征、手足徐動(dòng)征、投擲癥、肌張力障礙等。PKD分家族性和散發(fā)性,其中家族性PKD呈常染色體顯性遺傳。PKD患者男性明顯多于女性,男女比例約為3-4：1。本病一般在兒童期或青春前期起病,30歲后癥狀多自發(fā)緩解或完全消失。發(fā)作頻率每天數(shù)次至數(shù)十次,最多可高達(dá)一百多次。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PRRT2為PKD的致病基因,并得到國內(nèi)外研究小組的證實(shí)。然而目前尚不清楚散發(fā)性PKD是否也攜帶PRRT2基因突變,PRRT2基因型是否與PKD臨床表型存在關(guān)系,另外PRRT2突變導(dǎo)致PKD的分子機(jī)制是什么也不明確。因此我們擬在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討PKD患者中PRRT2基因突變特征,PKD基因型-表型間關(guān)系,并初步探討PKD的發(fā)病機(jī)制。第一部分發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙散發(fā)病例PRRT2基因突變的特征目的：探討散發(fā)性PKD患者中PRRT2基因突變特征方法：共收集41例散發(fā)性PKD患者,抽取靜脈血3 mL,標(biāo)準(zhǔn)法提取DNA,Sanger法測(cè)PRRT2基因序列,PRRT2陰性者進(jìn)一步篩查MR1,SLC2A1,CLCN1基因。選取18個(gè)SNPs進(jìn)行單體型分析。結(jié)果：41例散發(fā)性PKD中有7例攜帶PRRT2突變,其中5例攜帶c.649dupC,1例攜帶c.649delC,1例攜帶c.133_136de1CCAG。進(jìn)一步篩查父母的PRRT2基因,5例患者父親或母親一方攜帶PRRT2突變,2例患者父母均無突變。34例PRRT2陰性的PKD患者中有1例攜帶SLC2A1基因c.363GA突變,2例攜帶CLCN1基因c.1205CT突變。單體型分析證實(shí)了家系的血緣關(guān)系。結(jié)論：散發(fā)性PKD患者攜帶PRRT2基因突變的比率較低；PRRT2突變具有外顯不全,新生突變特征；臨床上應(yīng)注意PKD與發(fā)作性持續(xù)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙及先天性肌強(qiáng)直的鑒別診斷。第二部分發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙基因型一表型關(guān)系目的：探討PKD基因型。表型關(guān)系及PRRT2突變與藥物反應(yīng)關(guān)系。方法：分2階段收集81例PKD病例(家族性44例,散發(fā)性37例),Sanger法測(cè)PRRT2基因序列,采集臨床資料,患者口服卡馬西平。比較PRRT2基因突變攜帶者及非攜帶者的臨床表現(xiàn)差異及對(duì)卡馬西平的反應(yīng)用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。結(jié)果：44例家族性患者及4例散發(fā)性患者發(fā)現(xiàn)4種PRRT2基因突變,包括c.514_517de1TCTG,c.649dupC,c.649delC,c.972delA。基因突變攜帶者臨床表現(xiàn)為舞蹈手足徐動(dòng)癥(48例),而非攜帶者表現(xiàn)為舞蹈手足徐動(dòng)癥(7例)或肌張力障礙(26例)(P=3.8×10-15)；與不攜帶基因突變的患者相比,攜帶基因突變的患者起病年齡更早(分別為7.63+3.72歲,13.52±.69歲)(P=2.2×10-11),每次PKD發(fā)作持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)(P=2.2×104)；所有的突變攜帶者對(duì)小劑量卡馬西平(50mg/d)完全反應(yīng),而94%非基因突變攜帶者對(duì)相同劑量卡馬西平反應(yīng)不完全(P1.1×10-20)。我們另外發(fā)現(xiàn)一例攜帶PRRT2基因c.649dupC突變的PKD患者同時(shí)攜帶CLCN1基因C.1723CT及c.2492AG錯(cuò)義突變,提示其合并先天性肌強(qiáng)直。結(jié)論：PKD患者中PRRT2基因突變攜帶者較非攜帶者起病年齡更早,臨床表現(xiàn)更重,但對(duì)小劑量卡馬西平完全反應(yīng)。當(dāng)攜帶PRRT2突變的PKD患者對(duì)卡馬西平反應(yīng)不完全時(shí)應(yīng)篩查其他基因。第三部分利用fMRI探討發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病相關(guān)腦區(qū)目的：利用fMRI探討發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病相關(guān)腦區(qū)方法：收集15例攜帶PRRT2突變的PKD患者(PKDm),15例不攜帶PRRT2突變的PKD患者(PKDnm),14例正常對(duì)照,Sanger法篩查PRRT2基因序列,西門子3.0 T核磁共振進(jìn)行腦部掃描。結(jié)果：與正常對(duì)照相比,PKD患者的功能網(wǎng)絡(luò)連接增加,而結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)連接減少。功能網(wǎng)絡(luò)分析提示PKDm組患者左側(cè)頂葉上回,顳下回,雙側(cè)中央后回由非種子區(qū)變?yōu)榉N子區(qū),而大腦的輔助運(yùn)動(dòng)區(qū)和背側(cè)扣帶回則由種子區(qū)變?yōu)榉欠N子區(qū)；PKDnm組患者中,雙側(cè)楔前葉和頂下葉變?yōu)榉欠N子區(qū),而額上回變?yōu)榉N子區(qū)。結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)分析提示PKD患者腹側(cè)扣帶回由種子區(qū)變?yōu)榉欠N子區(qū),而矩狀裂由非種子區(qū)變?yōu)榉N子區(qū)。同時(shí),額上回在PKDm組變?yōu)榉N子區(qū),右側(cè)尾狀核和左側(cè)島葉在PKDnm組變?yōu)榉欠N子區(qū)。結(jié)論：PKD患者的功能網(wǎng)絡(luò)連接增加而結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)連接減少。軀體感覺運(yùn)動(dòng)整合功能的異常可能是PKD的發(fā)病機(jī)制之一。第四部分發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病機(jī)制初步探討目的：初步探討發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)病機(jī)制方法：構(gòu)建野生型(WT)及各種突變型(c.514_517delTCTG, c.649dupC, C.796CT,c.913GA,c.972delA)PRRT2慢病毒質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,提取RNA進(jìn)行RT-PCR及Real Time PCR。各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株用10 μmol/L胞乳素干預(yù)24 h后提取總蛋白,Western Blot檢測(cè)PRRT2蛋白改變。培養(yǎng)PKD患者及正常對(duì)照的尿液上皮細(xì)胞,利用攜帶6因子(Oct4、Sox2、cMyc、Klf4、Nanog、Lin28)的腺病毒轉(zhuǎn)染尿液上皮細(xì)胞重編程得到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPS),用堿性磷酸酶活性檢測(cè),畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等鑒定iPS。結(jié)果：我們成功構(gòu)建野生型及突變型PRRT2慢病毒質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證成功,RT-PCR及Real Time PCR結(jié)果提示各突變型PRRT2細(xì)胞系與WT-PRRT2細(xì)胞mRNA水平無顯著性差異。胞乳素干預(yù)后野生型PRRT2蛋白變化不明顯,而突變型PRRT2蛋白水平明顯增加。轉(zhuǎn)染尿液上皮細(xì)胞后30天,得到形態(tài)類似ES的iPS克隆,用堿性磷酸酶活性檢測(cè)提示細(xì)胞未分化,畸胎瘤實(shí)驗(yàn)提示可形成三個(gè)胚層。結(jié)論：突變型PRRT2不影響mRNA的水平但會(huì)增加蛋白的降解。利用尿液上皮細(xì)胞構(gòu)建iPS方法可行,且獲得的iPS具有多項(xiàng)分化潛能。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙 PRRT2 卡馬西平 fMRI iPS
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-19
• 參考文獻(xiàn)16-19
• 第一部分 發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙散發(fā)病例PRRT2基因突變特征19-36
• 材料與方法19-28
• 結(jié)果28-34
• 討論34-35
• 小結(jié)35-36
• 第二部分 發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙基因型表型關(guān)系36-51
• 材料與方法36-40
• 結(jié)果40-48
• 討論48-50
• 小結(jié)50-51
• 第三部分 利用fMRI探討發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病相關(guān)腦區(qū)51-63
• 材料與方法53-55
• 結(jié)果55-61
• 討論61-62
• 小結(jié)62-63
• 第四部分 發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙發(fā)病機(jī)制初步探討63-86
• 材料與方法63-78
• 結(jié)果78-84
• 討論84-85
• 小結(jié)85-86
• 參考文獻(xiàn)86-91
• 全文總結(jié)91-92
• 綜述92-105
• 參考文獻(xiàn)98-105
• 附表105-110
• 博士期間發(fā)表論文110-111
• 致謝111-112

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本文編號(hào)：954060