本文關(guān)鍵詞：水通道AQP4參與嗎啡依賴的機(jī)制研究

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【摘要】：毒品問題嚴(yán)重影響了社會的穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。在我國,嗎啡型毒品的危害程度、蔓延速度和影響范圍非常之大。嗎啡(morphine)是阿片(opium)的主要成分,是一種強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥。人們發(fā)現(xiàn)反復(fù)給予治療劑量的嗎啡后,其效力隨之減弱,逐漸形成耐受(tolerance),此時必須增加劑量才可以繼續(xù)起效。濫用藥物者為了體驗和追求嗎啡所帶來的欣快作用和避免停藥后所帶來的不適感,逐漸產(chǎn)生了成癮(addiction)或稱之為依賴(dependence)。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,包括阿片在內(nèi)的精神活性物質(zhì)依賴的本質(zhì)是機(jī)體長期接觸精神活性物質(zhì)后,中樞神經(jīng)系統(tǒng)在分子、細(xì)胞及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平發(fā)生的代償性適應(yīng)。目前關(guān)于嗎啡成癮的機(jī)制尚未完全闡明,幾乎所有的中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)都有不同程度的參與。且這個過程不僅僅局限于神經(jīng)元,膠質(zhì)細(xì)胞也參與其中。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性遞質(zhì),參與了嗎啡依賴的形成,并可能是嗎啡依賴過程中重要的機(jī)制分子之一。細(xì)胞外谷氨酸的濃度主要靠谷氨酸轉(zhuǎn)運體的調(diào)節(jié),谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(Glutamate Transporter-1,GLT-1)是這些谷氨酸轉(zhuǎn)運體中分布最廣、最主要的功能執(zhí)行者。文獻(xiàn)報道GLT-1參與了嗎啡依賴的形成。但GLT-1如何影響嗎啡依賴的形成過程及具體機(jī)制尚未完全闡明。水通道4(Aquaporin 4,AQP4)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的水通道亞型,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水代謝和滲透壓調(diào)節(jié)中占據(jù)主導(dǎo)地位。我室前期實驗證明AQP4與嗎啡成癮密切相關(guān),在嗎啡依賴形成過程中,AQP4與GLT-1的表達(dá)均下調(diào)。AQP4基因敲除能夠抑制嗎啡慢性處理所致的GLT-1表達(dá)下調(diào)、谷氨酸重攝取能力的降低及突觸間隙谷氨酸水平的改變,并且給予GLT-1特異性抑制劑二氫卡因酸鹽(Dihydrokainate,DHK)能夠增加AQP4基因敲除小鼠嗎啡軀體依賴的形成。但AQP4與GLT-1之間是否有直接關(guān)系仍然不清楚。根據(jù)文獻(xiàn)報道,AQP4與GLT-1均特異性的分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞中,且都參與了嗎啡依賴的形成過程,提示AQP4可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)及功能,影響突觸間隙谷氨酸的水平來影響嗎啡依賴的形成�？紤]到AQP4與GLT-1在功能上尚未發(fā)現(xiàn)有交互關(guān)系,因此我們推測AQP4通過與GLT-1能形成大分子復(fù)合體,借助蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制,調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)及功能。有文獻(xiàn)報道阿片依賴時腦內(nèi)蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性增加,并且可能與阿片依賴與耐受的形成有關(guān)。AQP4的表達(dá)受到PKC的調(diào)控,PKC的活化能夠抑制AQP4的表達(dá)。因此我們推測嗎啡依賴形成過程中,嗎啡通過阿片受體激活后續(xù)信號通路調(diào)控PKC活性,活化的PKC進(jìn)而調(diào)控AQP4的表達(dá)及AQP4相關(guān)復(fù)合物的功能,從而影響阿片依賴的形成。本課題希望通過這些研究深入了解AQP4在嗎啡依賴過程中的作用,為加深對AQP4功能的了解及嗎啡依賴的生物學(xué)研究開拓新領(lǐng)域。實驗方法:1)大鼠采用遞增給藥的方式,從第1天至第5天皮下注射嗎啡,劑量分別10、20、30、40、50 mg/kg,每天兩次(8:00和17:00),建立慢性嗎啡軀體依賴模型。用戒斷癥狀評分以判斷模型建立是否成功。通過實時定量PCR(Real-time PCR)和Western blot方法,從mRNA水平和蛋白水平檢測AQP4、GLT-1、μ阿片受體(Mu Opiate Receptor,MOR)在大鼠前額葉皮層、海馬、伏隔核及紋狀體的表達(dá)變化。2)采用二丁酰環(huán)腺苷酸(N6,2’-O-Dibutyryladenosine 3’5’-cyclic monophosphate sodium salt,d Bc AMP)誘導(dǎo)法培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞加入1μM的嗎啡作用72 h建立嗎啡依賴模型。用能否發(fā)生納洛酮超射現(xiàn)象判斷模型是否成功。從m RNA水平和蛋白水平檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AQP4、GLT-1、MOR的表達(dá)變化。3)首先通過免疫熒光化學(xué)的方法,分別對大鼠大腦皮層冰凍切片和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色,觀察AQP4、GLT-1和MOR的共定位情況。提取大鼠大腦皮層和體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的蛋白,通過免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法和熒光能量共振轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)方法驗證大分子復(fù)合物的存在。4)建立外源表達(dá)的AQP4-p EGFP-N1、GLT-1-p Ds Red的載體,共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞,以進(jìn)一步驗證復(fù)合物的存在。通過分子生物學(xué)方法對AQP4進(jìn)行突變,將C末端缺失,尋找與AQP4和GLT-1相互作用相關(guān)的區(qū)域。5)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上給予PKC的激動劑丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和拮抗劑白屈菜赤堿(chelerythrine),觀察PKC信號通路如何影響AQP4、GLT-1、MOR的表達(dá),與嗎啡依賴過程中這三個分子表達(dá)的變化有何關(guān)系,進(jìn)一步闡明機(jī)制。實驗結(jié)果:1)成功建立了大鼠軀體依賴模型。造模成功的大鼠表現(xiàn)出濕狗樣搖體、齒抓、咀嚼、縱涎、流淚、毛發(fā)直立、眼瞼下垂、腹瀉等戒斷癥狀,納洛酮伴隨給藥組未出現(xiàn)明顯戒斷癥狀。嗎啡依賴后,大鼠的前額葉皮層、海馬、伏隔核和紋狀體四個腦區(qū)的AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白均表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢,納洛酮伴隨給藥組AQP4、GLT-1、MOR的下調(diào)被抑制。2)優(yōu)化了原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法,并且建立了星形膠質(zhì)細(xì)胞的嗎啡依賴模型。嗎啡依賴的星形膠質(zhì)細(xì)胞在加入納洛酮后出現(xiàn)超射。嗎啡依賴后,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白均表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢,納洛酮伴隨給藥組AQP4、GLT-1、MOR的下調(diào)被抑制。3)通過免疫組化的方法證明,在大鼠大腦皮層和星形膠質(zhì)細(xì)胞中,AQP4、GLT-1、MOR顯示在細(xì)胞膜上共定位。進(jìn)一步采用免疫共沉淀和熒光能力共振轉(zhuǎn)移的方法證明,在大鼠大腦皮層組織和體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,AQP4和GLT-1可相互被沉淀下來且可以發(fā)生FRET現(xiàn)象。AQP4和MOR也相互被沉淀下來且可以發(fā)生FRET現(xiàn)象。但是GLT-1和MOR不能相互被沉淀下來且沒有發(fā)生FRET現(xiàn)象。4)構(gòu)建AQP4、GLT-1和AQP4的C末端缺失表達(dá)載體,幾種載體在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)效率較高。將AQP4-p EGFP-N1和GLT-1-p Ds Red共轉(zhuǎn)于293細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)的野生型AQP4和GLT-1可以相互被沉淀下來。將AQP4-CTD-p EGFP-N1和GLT-1-p Ds Red共轉(zhuǎn)于293細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)C末端缺失的AQP4和GLT-1不能相互被沉淀下來。5)給予PKC的激動劑PMA可減少星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4、GLT-1、MOR的表達(dá),給予PKC的拮抗劑后再進(jìn)行嗎啡慢性給藥,嗎啡慢性處理導(dǎo)致的AQP4、GLT-1、MOR的下調(diào)被抑制。結(jié)論:1)在大鼠的軀體嗎啡依賴模型和體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞嗎啡依賴模型中,均發(fā)現(xiàn)AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)。提前給予納洛酮拮抗MOR,可抑制它們的下調(diào),說明在嗎啡依賴過程中這三個分子的變化是與μ阿片受體直接相關(guān)的。2)AQP4和GLT-1在生理狀態(tài)下以復(fù)合物的形式存在,同時AQP4在體內(nèi)還與MOR形成復(fù)合物參與嗎啡依賴的調(diào)節(jié)。GLT-1和MOR雖然分布具有重疊,但并不能形成復(fù)合物。3)外源表達(dá)的AQP4和GLT-1也可以形成復(fù)合物,AQP4的C末端與AQP4和GLT-1的相互作用有關(guān)。4)阻斷PKC信號通路可以抑制嗎啡慢性處理所導(dǎo)致的AQP4、GLT-1、MOR下調(diào)。本研究首次證實了AQP4/GLT-1、AQP4/MOR復(fù)合物的存在。嗎啡通過激活μ受體及受體后PKC信號通路,下調(diào)AQP4的表達(dá)。AQP4通過蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制,調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)及功能,進(jìn)而影響突觸間隙谷氨酸的水平來參與嗎啡依賴的形成。以上結(jié)果為闡明AQP4參與嗎啡依賴的分子機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：AQP4 GLT1 嗎啡依賴 蛋白復(fù)合物 機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.64
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-20
• 第一章 AQP4、GLT-1、MOR在大鼠嗎啡軀體依賴模型中的表達(dá)變化20-42
• 一、前言20-21
• 二、材料與方法21-31
• 三、結(jié)果31-40
• 四、討論40-42
• 第二章 AQP4、GLT-1、MOR在星形膠質(zhì)細(xì)胞嗎啡依賴模型中的表達(dá)變化42-53
• 一、前言42
• 二、材料與方法42-48
• 三、結(jié)果48-51
• 四、討論51-53
• 第三章 大分子蛋白復(fù)合體的驗證53-80
• 一、前言53
• 二、材料與方法53-65
• 三、結(jié)果65-78
• 四、討論78-80
• 第四章 AQP4參與嗎啡依賴的相關(guān)信號通路80-86
• 一、前言80
• 二、材料與方法80-82
• 三、結(jié)果82-84
• 四、討論84-86
• 總結(jié)86-87
• 參考文獻(xiàn)87-95
• 綜述95-104
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 個人簡歷104-105
• 致謝10

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1 曹君利,丁海雷,何建華,張勵才,王俊科,曾因明;脊髓蛋白激酶Cα和γ亞型在嗎啡依賴和戒斷反應(yīng)中的不同作用[J];生理學(xué)報;2005年02期

2 胡金城,朱成全,汪學(xué)軍;嗎啡依賴大鼠鎮(zhèn)痛及生殖功能的改變[J];四川解剖學(xué)雜志;2005年01期

3 李艷萍;路軍秀;史福軍;汪艷麗;;實驗性嗎啡依賴大鼠腎皮質(zhì)組織化學(xué)變化[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2007年01期

4 楊光;劉小粉;劉寧;張潔;鄭佳威;孫華英;張文德;馬原野;;慢性嗎啡給予、戒斷及再給藥過程中大鼠海馬感覺門控的動態(tài)變化[J];生理學(xué)報;2007年03期

5 闞慕潔;崔佳樂;劉暢;洪敏;;嗎啡對大鼠腎功能部分血漿生化指標(biāo)影響的評估[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2007年08期

6 丘宏強(qiáng);何方;陳崇宏;;丹參提取物對豚鼠回腸體外嗎啡依賴性的影響[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2008年01期

7 于動震;吳紅海;侯艷寧;;孕酮對大鼠嗎啡位置偏愛相關(guān)腦區(qū)中β-內(nèi)啡肽水平的影響[J];華北國防醫(yī)藥;2008年02期

8 閆彩珍;于亮;劉川;郝曉玲;王天魁;;嗎啡依賴大鼠不同腦區(qū)肌動蛋白及其結(jié)合蛋白的表達(dá)變化[J];中國藥理學(xué)通報;2011年08期

9 郭韜;鄭杰;康進(jìn)生;董長征;武江;岳向勇;李文玲;趙文清;梁晴;;嗎啡急性成癮貓癥狀學(xué)與神經(jīng)電生理變化[J];中國老年學(xué)雜志;2011年18期

10 劉小粉;楊光;楊銳;賈強(qiáng);關(guān)宿東;;氣味線索對小鼠形成嗎啡依賴及渴求的影響[J];動物學(xué)研究;2012年02期

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