本文關(guān)鍵詞：AAV-BDNF拮抗淀粉樣β蛋白所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的典型病理改變是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元的缺失。作為老年斑的主要成分,淀粉樣β蛋白(A β)可以誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng),傷害突觸可塑性,進(jìn)而使AD患者認(rèn)知功能下降。Aβ的神經(jīng)毒性作用機制十分復(fù)雜,目前還尚未徹底闡明。近年來,越來越多的研究表明異常AD與免疫應(yīng)答相關(guān)。炎癥反應(yīng)存在于AD患者腦內(nèi),這可能是由于AD患者腦內(nèi)的淀粉樣蛋白以免疫原的形式引發(fā)了腦的非特異性免疫應(yīng)答。免疫清除機制一旦被激活,從而引起了炎癥反應(yīng)。這種非特異性免疫應(yīng)答涉及膽堿能神經(jīng)元參與的變性反應(yīng)。研究表明,A β1-42可以誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥。在注射Aβ的腦區(qū)如海馬,可有膠質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子數(shù)量的增加。此外,AD患者腦內(nèi)也存在突觸變性。有證據(jù)表明,在A β1-42不斷聚集的過程中,突觸的數(shù)量也在逐漸減少。我們實驗室先前的研究也證實,海馬內(nèi)注射Aβ可明顯傷害突觸可塑性和動物的空間記憶功能。因此,AD發(fā)病機制的Aβ學(xué)說已經(jīng)被廣泛認(rèn)可,Aβ的神經(jīng)毒性作用機制以及拮抗其效應(yīng)的研究已經(jīng)成為目前AD研究領(lǐng)域的一個重要方向。 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),對神經(jīng)元的存活、分化、生長發(fā)育起重要作用,是目前最為認(rèn)可的與突觸可塑性、突觸生長有關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)。BDNF能防止Aβ引起的神經(jīng)元死亡、凋亡,減輕神經(jīng)元的病理狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn),AD時頂葉皮層和海馬部位的BDNF有明顯減少。也有研究證實,BDNF在細(xì)胞水平可以完全逆轉(zhuǎn)Aβ1-42引起的細(xì)胞傷害。這表明,BDNF的表達(dá)下調(diào)可能與AD的發(fā)生相關(guān)。我們推測：提高腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平,有可能對包括膽堿能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)元的存活、分化和生長起到積極作用,從而拮抗Aβ引起的神經(jīng)元損傷和突觸傷害作用,在一定程度上改善或提高AD患者的學(xué)習(xí)與記憶能力。然而,通過提高內(nèi)源性BDNF以對抗A β1-42神經(jīng)損傷的在體實驗研究目前仍缺乏足夠的實驗證據(jù)。 本研究采用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)作為基因轉(zhuǎn)移的載體,研究了在體AAV-BDNF表達(dá)對Aβ1-42所致的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶傷害作用的生物學(xué)效應(yīng)。AAV是單鏈DNA病毒,屬于微小病毒科。由于AAV本身是一個天然缺陷型病毒,對宿主免疫原性弱,安全性好；同時AAV具有廣泛的組織和細(xì)胞親嗜性,并可在體內(nèi)穩(wěn)定地長時間表達(dá)外源性基因。因此,AAV是目前發(fā)展最有希望的載體之一。本實驗運用在體行為學(xué)測試方法和電生理記錄手段探討了AAV-BDNF拮抗Aβ1-42的神經(jīng)保護(hù)作用及其可能機制。實驗研究分為兩個部分：(1)運用Morris水迷宮行為學(xué)測試方法觀察了AAV-BDNF對Aβ1-42所致空間學(xué)習(xí)記憶損傷的逆轉(zhuǎn)作用；(2)利用在體大鼠海馬CA1區(qū)場電位記錄手段,觀察了AAV-BDNF對Aβ1-42所致突觸可塑性傷害的電生理效應(yīng)。 第一部分AAV-BDNF對Aβ1-42所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的保護(hù)效應(yīng)觀察 目的：研究在體AAV-BDNF表達(dá)對A β1-42所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶傷害作用的生物學(xué)效應(yīng)。 方法：實驗選用無視力和運動障礙的成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,將其隨機分為四組：AAV+PBS, AAV+Aβ1-42, AAV-BDNF+PBS, AAV-BDNF+Aβ1-42。SD大鼠麻醉后,在立體定位儀的引導(dǎo)下,應(yīng)用微量注射泵將AAV-BDNF,Aβ1-42或PBS等緩慢注射到雙側(cè)海馬內(nèi)。動物清醒后恢復(fù)三到四周,進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測試。測試分定位航行實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗三部分。主要觀察指標(biāo)為：對大鼠尋找水下平臺的平均逃避潛伏期、平均游泳距離、撤去平臺后大鼠在目標(biāo)象限游泳時間和距離所占百分比。 結(jié)果：(1)雙側(cè)海馬各注射5μg Aβ1-42(AAV+Aβ1-42)顯著降低了大鼠的空間學(xué)習(xí)與記憶能力。在訓(xùn)練第2-5天,大鼠尋找水下平臺的時間和游過的距離明顯延長(P0.01)。例如,在第5天時,A β1-42組大鼠逃避潛伏期為72.38±2.62s,明顯大于對照組(AAV+PBS)的16.05±3.21s(P0.01)；空間探索實驗中,Aβ1-42組大鼠在目標(biāo)象限的游泳時間和距離明顯小于對照組,如游泳時間占游泳總時間的百分比為25.03±1.56%,明顯小于對照組的44.79±1.61%(P0.01).(2) AAV-BDNF單獨給予(AAV-BDNF+PBS)不影響大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力,與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差別(P0.05)。(3)AAV-BDNF+Aβ1-42組中,大鼠逃避潛伏期明顯小于Aβ1-42單獨給予組(P0.01)；目標(biāo)象限游泳時間則明顯大于Aβ1-42單獨給予組(P0.01)。(4)AAV-BDNF和A β1-42的單獨使用及聯(lián)合應(yīng)用均未影響大鼠的視力和運動能力,各組游泳速度和逃避潛伏期均無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：以上結(jié)果表明,雙側(cè)海馬注射A β1-42嚴(yán)重?fù)p害了大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力,而腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染BDNF可拮抗A β1-42引起的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。這一結(jié)果提示,腦內(nèi)BDNF的高表達(dá)有可能在AD等神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮積極作用。 第二部分：AAV-BDNF對Aβ1-42所致海馬突觸可塑性傷害的電生理效應(yīng)觀察 目的：利用電生理學(xué)在體場電位記錄手段,觀察分別或聯(lián)合給予Aβ1-42和AAV-BDNF時,海馬CA1區(qū)突觸可塑性的變化,探討AAV-BDNF拮抗A β1-42所致空間學(xué)習(xí)記憶損傷的可能電生理學(xué)機制。 方法：將成年雄性SD大鼠麻醉后,固定于腦立體定位儀上。將綁定的雙電極(刺激電極和記錄電極)按解剖學(xué)位置插入到海馬內(nèi)。通過刺激(單刺激,強直刺激,雙脈沖刺激)海馬Schaffer側(cè)枝,在海馬CA1區(qū)誘發(fā)和記錄基礎(chǔ)的fEPSPs、fEPSP的長時程增強(long term potentiation, LTP)以及雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)。 結(jié)果：(1)與正常對照組(AAV+PBS)目比,AAV-BDNF單獨給予(AAV-BDNF+PBS)沒有影響海馬LTP。其在給予HFS后Omin,30min,60min時分別為：183.66±4.36%,153.06±1.85%和145.07±2.14%；(2)A β1-42(AAV+Aβ1-42)明顯壓抑了海馬LTP, HFS刺激后Omin,30min,60min, fEPSPs的平均斜率分別為151.57±6.90%,126.69±4.83%,117.18±2.77%(P0.01)；(3)AAV-BDNF明顯逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42引起的LTP壓抑效應(yīng),在HFS刺激后60分鐘時,聯(lián)合給予AAV-BDNF和Aβ1-42組的fEPSPs平均斜率由A β1-42單獨處理組的117.18±2.77%增加到143.77±3.06%；(4)各組PPF均不受各種藥物的影響。 結(jié)論：海馬內(nèi)注射A β1-42可明顯壓抑HFS引起的LTP；海馬內(nèi)單獨注射AAV-BDNF不影響海馬LTP,但AAV-BDNF預(yù)處理可以有效逆轉(zhuǎn)A β1-42引起的LTP壓抑；A β1-42與AAV-BDNF對突觸可塑性的影響主要是通過突觸后機制實現(xiàn)的。 以上兩部分實驗初步證實了我們的假設(shè)：提高腦內(nèi)特別是海馬內(nèi)的BDNF表達(dá)水平能夠保護(hù)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能免受Aβ引起的傷害,而海馬突觸可塑性的正常維持可能是BDNF改善學(xué)習(xí)記憶行為的一個重要的電生理機制。 目的：抑郁和行為脫抑制是老年人尤其是阿爾茨海默病(AD),也是AD發(fā)病風(fēng)險因素之一。已有實驗證實,淀粉樣β蛋白(Aβ)參與了AD患者腦內(nèi)神經(jīng)退行性變過程,與認(rèn)知功能下降密切相關(guān)。但Aβ是否直接影響焦慮和抑郁行為及其可能的突觸機制尚不清楚。方法：本研究聯(lián)合采用高架十字迷宮、強迫游泳及電生理實驗技術(shù),觀察了海馬內(nèi)注射Aβ1-42寡聚體對大鼠焦慮、抑郁行為及海馬突觸可塑性的影響。結(jié)果：與對照組相比,Aβ1-42組大鼠在高架十字迷宮開臂中停留的總時間明顯延長、強迫游泳測試不動時間明顯增加、在體海馬長時程增強(LTP)受到明顯抑制。結(jié)論：海馬內(nèi)注射Aβ可導(dǎo)致大鼠行為脫抑制、引起抑郁樣行為并傷害突觸可塑性,提示海馬LTP的異常不僅影響學(xué)習(xí)記憶功能,可能也與焦慮和抑郁等精神行為異常的發(fā)生有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：AAV-BDNF A β1-42 空間學(xué)習(xí)與記憶 Morris水迷宮 海馬長時程增強(LTP) 阿爾茨海默病(AD) 淀粉樣β蛋白 行為脫抑制 抑郁 海馬長時程增強
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 第一章 AAV-BDNF拮抗淀粉樣β蛋白所致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)研究5-40
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-22
• 結(jié)果22-32
• 討論32-35
• 參考文獻(xiàn)35-40
• 第二章 海馬內(nèi)注射Aβ1-42寡聚體影響大鼠焦慮、抑郁行為及突觸可塑性40-54
• 中文摘要41-42
• 英文摘要42-43
• 前言43
• 材料與方法43-45
• 結(jié)果45-49
• 討論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 綜述54-65
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉朝暉;馬東亮;靳輝;馬延兵;胡海濤;;病毒載體介導(dǎo)BDNF基因表達(dá)在大鼠神經(jīng)元AD模型中的作用[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年10期

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本文編號：902077