本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化定量方法的建立及用于精神病樣本的分析

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【摘要】：背景與目的構(gòu)成人體的每一個細胞內(nèi)都有全套基因的核苷酸序列,這些基因可以編碼機體構(gòu)成所必須的全部部件,然而這些基因的編碼序列并不是都有活性,有活性的基因在整套基因中僅占少數(shù),大部分處于表達失活狀態(tài)�；虻谋碛^遺傳修飾有協(xié)助控制基因表達活性的作用,以保證基因在準確的空間和時間發(fā)揮或抑制表達。DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,使核酶、限制性內(nèi)切酶失去識別位點而失去轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化作為一種非常重要的表觀遺傳修飾方式,具有著雙重作用：一方面,它能夠保持基因組的穩(wěn)定性；另一方面,它同時也可以保持基因表達在空間與時間上的特異性。DNA甲基化是甲基轉(zhuǎn)移酶把甲基選擇性地轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上構(gòu)成5-甲基胞嘧啶的過程,一般發(fā)生在CpG二核苷酸的C上。DNA復(fù)制后,甲基化酶可基本穩(wěn)定地將親代DNA的甲基化狀態(tài)復(fù)制到新形成的DNA中,把未甲基化位點進行甲基化,如此甲基化模式可以代代相傳。DNA甲基化會因內(nèi)外環(huán)境的變化而發(fā)生改變,把環(huán)境作用和機體反應(yīng)聯(lián)系在一起。DNA甲基化從發(fā)現(xiàn)之后,就被大量地列入研究日程。人們已經(jīng)建立了許多DNA甲基化水平的檢測方法。目前存在的檢測方法,概括起來可分為三類,分別用于基因組總體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的探查。本研究的切入點在于單個CpG位點甲基化水平的檢測。已存在的特異位點甲基化水平定量的方法比較常用的有焦磷酸測序、熒光素標(biāo)記的探針檢測技術(shù)、熒光能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)和一種實時定量PCR甲基化檢測技術(shù),這些技術(shù)整體上給特異位點甲基化檢測留下了操作復(fù)雜,儀器和設(shè)備成本高,定量結(jié)果偏差較大等缺陷,新技術(shù)的產(chǎn)生可為甲基化研究提供有利的工具。為此,本研究在亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換和PCR擴增基礎(chǔ)上,建立了名為甲基化特異的單核苷酸標(biāo)記延伸技術(shù)(Bisulfite conversion-specific one-label extension, BS-OLE)的甲基化檢測新方法�；趩魏塑账嵋镅由斓脑�,BS-OLE技術(shù)使用BS-引物與目標(biāo)位點上游緊臨的序列結(jié)合,然后熒光標(biāo)記的dCTP或dUTP通過單堿基延伸而分別摻入到引物下游的以甲基化形式(CpG)或非甲基化形式(TpG)存在的目標(biāo)位點上,以產(chǎn)物的熒光偏振值(Fluorescence polarization, FP)高低來確定待測DNA目標(biāo)序列中CpG位點的甲基化水平。人類基因組大約有一半來源于轉(zhuǎn)座子,它們也被稱為跳躍基因,可以從基因組中任何一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置,這種轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在染色體內(nèi),也可以發(fā)生在染色體間。轉(zhuǎn)座子的活動,會影響基因組的穩(wěn)定性,產(chǎn)生突變或積累成新基因,進而促進人類基因組的遺傳革新。LINE1和Alu-Y均是人類基因組中最常見、最豐富、最活躍的轉(zhuǎn)座子。LINE1大約有50萬個拷貝,Alu-Y大約有100萬個拷貝,在這數(shù)量龐大的轉(zhuǎn)座子中,僅有少數(shù)序列完整的有轉(zhuǎn)位活性,大部分處于失活狀態(tài),然而因為它們在DNA中所占比例很高,LINE占17%,Alu-Y占11%,所以在基因組里具有非常重要的位置。LINE1和Alu-Y甲基化已被用作全基因組甲基化水平的生物標(biāo)志物,分析它們與一些疾病的相關(guān)性,如肺癌、結(jié)腸癌、局部缺血性心臟病(Ischemic Heart Disease, IHD)、腎細胞癌等。精神分裂癥和雙相情感障礙是兩種常見的精神病,由于高發(fā)率和極低的治愈率,給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。精神分裂癥患者表現(xiàn)出一系列臨床癥狀,如偏激、妄想、幻想、認知損傷、情感障礙、意志行為障礙等。雙相情感障礙是一種兼有躁狂狀態(tài)和抑郁狀態(tài)的精神病,這兩種狀態(tài)可在同一病患身上反復(fù)交替發(fā)作,僅在間歇期病人才是正常的。雖然遺傳性在發(fā)病因素占很重要的位置,但是同卵雙生子的發(fā)病一致性遠遠沒有達到100%,這表明非遺傳因素在病因?qū)W中也占據(jù)著非常重要的位置。本項研究以LINE1元件的甲基化為示例,建立基于熒光偏振檢測的甲基化特異的單核苷酸標(biāo)記延伸技術(shù)(BS-OLE),檢測單個CpG位點甲基化的方法。利用此BS-OLE方法,檢測精神病包括精神分裂癥和雙相情感障礙外周血樣本中LINE1和Alu-Y亞家族的甲基化修飾的變化情況,篩選與疾病相關(guān)的DNA甲基化位點,從表觀遺傳角度闡述這兩種精神病的發(fā)病機制。材料與方法1.實驗材料(1) BS-OLE甲基化檢測方法的建立所用材料用外周血細胞全基因組DNA、重組質(zhì)粒DNA、5-aza-dCTP處理過的HEK293T細胞DNA分別對BS-OLE甲基化檢測方法實行穩(wěn)定性、準確性驗證。這些材料都用試劑盒提取,溶解在TE溶解液中,保存于-20±。重組質(zhì)粒構(gòu)建所用載體為pMD18T載體,感受態(tài)細胞為DH-5α。常規(guī)培養(yǎng)的M059K人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、人骨肉瘤細胞U20S、人膠質(zhì)母細胞瘤T98G細胞、A172膠質(zhì)母細胞瘤細胞、U87人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞、HEK293T細胞的基因組DNA用試劑盒提取,溶解在TE溶解液中,保存于-20±,用于BS-OLE甲基化檢測方法在小樣本中的應(yīng)用實驗。(2) BS-OLE甲基化檢測方法在精神病分析中的應(yīng)用所用材料抽取92例精神分裂癥患者、99例雙相情感障礙患者和92例正常對照的靜脈外周血,用傳統(tǒng)酚一氯仿法提取基因組DNA,溶于TE溶解液中,保存于-20±作為測試樣本,用于分析LINE1和Alu-Y上特異位點甲基化水平與精神分裂癥和雙相情感障礙的相關(guān)性。2.實驗方法(1)DNA甲基化轉(zhuǎn)換用偏重亞硫酸鈉鹽處理DNA完成甲基化轉(zhuǎn)換,被處理的DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)因脫氨而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U),經(jīng)過PCR擴增后會變成胸腺嘧啶(T),被處理的DNA中發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)則保持胞嘧啶的形式不變,經(jīng)過PCR擴增后仍然是胞嘧啶(C)。那么,對原DNA甲基化的檢測就轉(zhuǎn)變?yōu)?對PCR擴增產(chǎn)物中目標(biāo)位點上胸腺嘧啶T和胞嘧啶C含量的比較。(2)PCR擴增和酶切擴增原來少量的目的片段,并將產(chǎn)物酶切,去除殘留的引物和dNTP,作為后繼實驗的材料,可減少對基因組DNA原材料的需求,酶切消除了擴增試劑對下游實驗的影響。(3) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建從甲基化轉(zhuǎn)換后的外周血DNA擴增出轉(zhuǎn)座子LINE1啟動子區(qū)的一段保守序列,將其與pMD18T載體連接,轉(zhuǎn)化入DH-5a感受態(tài)細胞,短時培養(yǎng)后涂板,從平板上的菌落中挑選出目標(biāo)位點上基因型分別為T和C的單克隆。(4) CORB A (Combined Bisulfite Restriction Analysis)實驗這個實驗用來與BS-OLE方法相互驗證。用核酸限制性內(nèi)切酶TaqI酶切甲基化水平分別為0%,20%,40%,60%,80%,100%樣本的PCR產(chǎn)物,將識別序列TCGA中胞嘧啶被甲基化的樣本的產(chǎn)物切斷,識別序列TCGA中胞嘧啶未被甲基化的樣本的產(chǎn)物,由于序列已由原來的"TCGA"變成"TTGA"而不能被切斷。把酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖電泳,根據(jù)電泳條帶的灰度確定識別位點甲基化水平。(5) 病例對照分析實驗用自己建立的BS-OLE檢測方法,定量精神分裂癥、雙相情感障礙和正常對照這三個實驗組受試對象全基因組LINE1和Alu-Y上的幾個特異CpG位點的甲基化水平,分析比較這三個實驗組間各個被測位點甲基化水平的差異,分析它們與精神病間的相關(guān)性。在分析中,視對照樣本的甲基化水平為標(biāo)準值,將其換算成100%,然后以相同比例將精神分裂癥組和雙相情感障礙組甲基化水平進行換算,再比較三者之間的差異。3.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理,使用的是IBM SPSS Statistics 20軟件。用相關(guān)性分析年齡和性別與甲基化之間的關(guān)系。由于所用樣本年齡不符合正態(tài)分布,所以在實驗組間比較時,采用協(xié)方差分析,性別為等級變量,年齡為連繼變量。所有的分析都是雙側(cè)分析。當(dāng)P0.05時統(tǒng)計結(jié)果達到顯著性水平。主要結(jié)果BS-OLE方法的穩(wěn)定性、準確性很好。理論值為25%的甲基化水平,用此方法檢測得到32.7±0.5%的甲基化水平,與理論值相差不大。在準確性實驗結(jié)果中,理論值為20%、40%、60%和80%的甲基化水平,用此方法檢測得到25.6±4.5%、39.8±3.9%、53.3±4.8%和75.7±2.2%,用COBRA方法測得甲基化水平分別為23.0±0.0%、44.5±2.5%、61.5%±2.5%、77.5±5.5%,這兩種方法結(jié)果的符合度很高。BS-OLE方法可檢測出用5-aza-dC培養(yǎng)的HEK293T細胞的甲基化水平隨5-aza-dC的濃度增加而減少。將此方法應(yīng)用于細胞水平甲基化檢測時,分別得到常規(guī)培養(yǎng)的癌細胞Y87、M059K、A172、U2OS、T98G和HEK293T的甲基化水平為48.7%±1.7%、41.4%±2.8%、39.3%±0.6%、33.7%±3.0%、30.9±1.6%和37.2±4.1%。正常對照、精神分裂癥和雙相情感障礙中LINE1上的3個CpG位點和Alu-Y上的4個CpG位點,共七個CpG位點,各位點與年齡及性別的相關(guān)性分別不同。正常對照樣本、精神分裂癥樣本和雙相情感障礙樣本之間的甲基化差異,無論是整體差異,還是男性樣本之間或女性樣本之間,在不同位點上甲基化差異的表現(xiàn)均不相同,但大部分CpG位點上這三組樣本間甲基化水平差異達到顯著性水平。有趣的是,在A3位點上,正常樣本、雙相情感障礙樣本和精神分裂癥樣本的甲基化水平依次增加,差異都達到了顯著水平。主要結(jié)論1. 以單堿基延伸為基礎(chǔ)建立的名為甲基化特異的單核苷酸標(biāo)記延伸技術(shù)(BS-OLE)的特異位點甲基化水平檢測方法的準確性、穩(wěn)定性均表現(xiàn)突出,是一種簡單可靠的新方法。2. LINE1和Alu-Y元件上都存在著與精神分裂癥和雙相情感障礙相關(guān)的特異CpG位點,尤其體現(xiàn)在Alu-Y元件上的A3處。A3有成為精神病診斷指標(biāo)的可能。3.從LINE1角度來看,精神分裂癥和雙相情感障礙患者甲基化水平都比正常人的低。
【關(guān)鍵詞】：DNA甲基 單堿基延伸 LINE Alu-Y 精神分裂癥 雙相情感障礙
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 第一章 前言17-26
• 1.1 DNA甲基化在人類基因組中的重要性17-18
• 1.2 已有DNA甲基化的檢測方法及新方法出現(xiàn)的必要性18-19
• 1.3 LINE1和Alu-Y簡介19-20
• 1.4 精神分裂癥和雙相情感障礙簡介20-21
• 1.5 精神分裂癥和雙相情感障礙的表觀遺傳學(xué)研究狀況21-23
• 1.6 LINE1和Alu-Y甲基化研究在精神分裂癥和雙相情感障礙中的重要意義23-26
• 第二章 材料和方法26-47
• 2.1 主要試劑26-28
• 2.2 主要溶液配制28
• 2.3 主要儀器28-29
• 2.4 方法與步驟29-47
• 第三章 結(jié)果47-68
• 3.1 DNA甲基化定量方法建立的實驗結(jié)果47-52
• 3.2 BS-OLE用于精神病樣本分析的結(jié)果52-68
• 第四章 討論68-73
• 第五章 結(jié)論73-74
• 參考文獻74-79
• 攻讀學(xué)位期間成果79-80
• 致謝80-82

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