本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質(zhì)干細胞移植改善阿爾茨海默病大鼠認知功能和減輕神經(jīng)病理損傷

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【摘要】：目的：阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，神經(jīng)元胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）沉積和胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillarytangles，NFT）為其主要病理特征，臨床上主要表現(xiàn)為認知功能障礙。目前，AD尚無有效的治療方法。人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）和人羊膜間充質(zhì)干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）具有良好神經(jīng)生物學(xué)特性和免疫調(diào)節(jié)作用，為AD的細胞治療提供了可能。本研究主要探討hAECs和hAMSCs移植對AD大鼠模型的治療效應(yīng)及生物學(xué)原理，評價其孰優(yōu)孰次，為臨床選擇更適合于治療AD的供體細胞提供實驗依據(jù)。 方法：①采用胰酶-膠原酶兩步消化法從足月分娩的人羊膜組織中分離hAECs和hAMSCs,用流式細胞儀（Flow cytometry， FCM）和免疫細胞化學(xué)（Immunocytochemistry，IC）法進行表型鑒定。②SD大鼠雙側(cè)腦室注射脂多糖（LPS）復(fù)制AD大鼠模型。模型大鼠隨機分為4組:模型組(n=12)、培養(yǎng)基對照組（n=12）、hAECs移植組（n=12）和hAMSCs移植組（n=12）。細胞移植組雙側(cè)海馬注射10ul hAECs或hAMSCs細胞懸液（5×105個細胞），培養(yǎng)基組同途徑注射等體積無血清L-DMEM培養(yǎng)基。同時設(shè)正常組作為平行對照。細胞移植后2W和4W，各組處死6只動物，取大腦和外周血進行病理學(xué)和免疫學(xué)檢查。③細胞移植前后和大鼠處死前分別水迷宮試驗檢測大鼠空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力的改變。④HE染色觀察皮層海馬組織的病理改變，硫磺素S染色觀察病變組織淀粉樣蛋白沉積和NFT。⑤免疫組化染色觀察Aβ42、Tau蛋白、Ach、CD68(小膠質(zhì)細胞）的表達，并用Image-ProPlus6.0圖像分析系統(tǒng)分析其陽性區(qū)積分光密度（IOD）值（反映目標檢測物的相對表達量）。⑥流式細胞術(shù)（FCM）檢測外周血CD4+IFN-γ（+Th1）、CD4+IL-4+（Th2）、CD4+IL-17+（Th17）和CD4+Foxp3+（Treg）T淋巴細胞亞群的變化。⑦流式微球芯片捕獲技術(shù)（cytometric bead array, CBA）檢測血清IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α和IFN-γ細胞因子含量變化。⑧免疫熒光染色檢測hAECs和hAMSCs在大腦移植區(qū)的存活及分化。 結(jié)果：①P3hAECs不表達CD34、CD45、HLA-DR、CD80和CD86，表達CD44、CD49f、CD326（Ep-CAM）、E-cad、CD29和CD73及CK19，具有良好的上皮表型特性。P3hAMSCs不表達CD34、HLA-DR、CD19、CD14、CD45、CD80和CD86，表達CD73、CD44、CD29，CD105和CD90及波形蛋白，，具有典型的MSCs表型特征。②與正常組比較，模型組從第3天開始大鼠逃避潛伏期明顯增加（P㩳0.01），跨越平臺次數(shù)減少（P㩳0.05），表明有明顯的空間探索性學(xué)習(xí)記憶障礙；細胞治療后2周，與模型組和培養(yǎng)基組比較，兩個細胞治療組從第3天起逃避潛伏期明顯縮短（均P㩳0.01），跨越平臺次數(shù)明顯增加（均P㩳0.05），接近于正常組（均P㩳0.05）；治療后4周， hAECs原位移植組從第4天起逃避潛伏期明顯縮短（P㩳0.05），而hAMSCs組與模型組和培養(yǎng)基組比較則無差別(均P㧐0.05)；與hAMSCs組比較，hAECs組逃避潛伏期明顯減少（P㩳0.05）。③模型組和培養(yǎng)基組動物大腦皮質(zhì)或海馬區(qū)神經(jīng)元明顯減少，排列紊亂，空泡化，淀粉樣斑塊和NFT沉積明顯；hAECs和hAMSCs移植組神經(jīng)元增多，排列正常，未見空泡化，淀粉樣斑塊和NFT明顯減少。④與模型組和培養(yǎng)基組比較，兩個細胞治療組Aβ42沉積均明顯減少（P㩳0.01，P㩳0.05）、異常磷酸化的Tau蛋白均明顯減少（P㩳0.01，P㩳0.05）、Ach水平升高（P㩳0.01，P㩳0.05）、CD68(小膠質(zhì)細胞)表達上調(diào)（P㩳0.01，P㩳0.05）；hAECs組Aβ沉積和Tau蛋白的減少以及Ach和CD68上調(diào)較之hAMSCs更為顯著（均P㩳0.01，P㩳0.05）。⑤與模型組和培養(yǎng)基組比較，細胞移植后2周，hAECs治療組外周血Th1和Th17細胞百分比下降（P㩳0.05），而Th2細胞上調(diào)（P㩳0.05），Th1類細胞因子IL-2和IFN-γ水平下調(diào)（均P㩳0.05），Th2類細胞因子IL-4下調(diào)（P㩳0.05），hAMSCs組的免疫指標與模型組和培養(yǎng)基組比較沒有變化（P㧐0.05）細胞亞群變化均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P㧐0.05）。⑥移植后4周，動物大腦移植區(qū)均可見hAECs和hAMSCs，并表達神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN）。 結(jié)論：hAECs和hAMSCs移植均可明顯改善AD大鼠空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)組織病理損傷，其機制與減輕Aβ沉積和Tau蛋白過度磷酸化有關(guān)。實驗結(jié)果表明，相對于hAMSCs，hAECs作為神經(jīng)退行疾病細胞治療的供體細胞更具價值。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 人羊膜間充質(zhì)干細胞 人羊膜上皮細胞 β淀粉樣蛋白 Tau蛋白 免疫調(diào)節(jié) 大鼠
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-23
• 2 結(jié)果23-36
• 3 討論36-40
• 4 結(jié)論40-41
• 參考文獻41-45
• 綜述45-53
• 參考文獻49-53
• 致謝53-54
• 作者簡介54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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6 方寧;張路;宋秀軍;章濤;陳代雄;;人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年03期

7 李丹;方寧;陳代雄;余麗梅;章濤;趙春華;;人羊膜上皮細胞治療大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用[J];中國免疫學(xué)雜志;2013年10期

本文編號：877385