本文關(guān)鍵詞：AnkG對小鼠精神行為和認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討

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【摘要】：背景：AnkG是由Ank3基因編碼的錨蛋白,在腦中廣泛分布,尤其是前額葉皮層、海馬及丘腦等處高表達(dá)。AnkG在腦中蛋白亞型主要有位于軸突起始段(AIS)和郎飛結(jié)處的270/480KD和位于軸膜近端的190KD,它們對動(dòng)作電位的產(chǎn)生、擴(kuò)布和再生及維持軸突-樹突極性有著重要作用,而且是神經(jīng)發(fā)生的必要蛋白。目前關(guān)于AnkG敲除小鼠的模型主要有AnkG外顯子1b敲除的小鼠模型和采用shRNA構(gòu)建的海馬齒狀回AnkG沉默的小鼠模型,這兩種模型小鼠腦中的AnkG表達(dá)量均是明顯下降的,而且通過行為學(xué)的檢測發(fā)現(xiàn)這兩種小鼠均具有躁狂和抑郁行為,不過這兩種模型小鼠模型均未進(jìn)行認(rèn)知相關(guān)的研究。最近全基因組關(guān)聯(lián)性研究表明,AnkG是雙向情感障礙、精神分裂癥及阿爾茨海默病發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)易感基因,而且有多個(gè)單核苷酸序列多態(tài)性與上述疾病發(fā)生相關(guān)。關(guān)于AnkG參與晚發(fā)性AD的發(fā)病,最近的研究表明AnkG和Ap在arcAp模型小鼠腦中的細(xì)胞外存在共定位。Ap是淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過p-分泌酶和γ-分泌酶相繼剪切后產(chǎn)生的,當(dāng)APP和PS1突變時(shí)都可以導(dǎo)致Ap的生成增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,給予arcAp模型小鼠AnkG主動(dòng)免疫治療之后,細(xì)胞外的老年斑明顯減少,可見AnkG可能通過調(diào)節(jié)Ap的病理改變從而參與AD的發(fā)生發(fā)展。AnkG在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用,且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)一種臨床常用的情緒穩(wěn)定劑丙戊酸鈉(VPA)可上調(diào)AnkG的表達(dá),其可通過影響特異基因啟動(dòng)子的甲基化或乙�；饔脕碚{(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)從而達(dá)到治療神經(jīng)精神疾病的作用,在我們的實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)AnkG缺失小鼠具有明顯的焦慮、抑郁和認(rèn)知功能障礙,在給予該類小鼠生理安全劑量的VPA后能使上述異常行為得到改善。這提示AnkG可能會(huì)成為治療神經(jīng)精神疾病的作用靶點(diǎn)。通過體外AnkG啟動(dòng)子介導(dǎo)熒光素酶報(bào)告基因活性的研究,探討VPA對AnkG表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,為精神性疾病的治療提供了新的治療路徑。 為了能更好的認(rèn)知AnkG在神經(jīng)精神疾病中的作用及潛在機(jī)制,我們將分別通過AnkG對小鼠精神行為和認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討、AnkG缺失對APP/PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠的影響和丙戊酸鈉對AnkG基因表達(dá)上調(diào)的機(jī)制研究三方面來探討。方法：采用基因捕獲的方法構(gòu)建了AnkG缺失的模型小鼠,通過曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮、明暗實(shí)驗(yàn)、糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮及避暗實(shí)驗(yàn)來鑒定該模型小鼠的行為學(xué),并采用Westernblotting檢測與行為改變相關(guān)的已知蛋白如GluR1、NMDAR1、GABRA1、GABA-BR1、GABA-BR2、PSD-95和BDNF。將AnkG缺失小鼠和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因的阿爾茨海默病模型小鼠雜交后獲得目的小鼠APP/PS-AnkG+/模型小鼠,通過新物體識別、Morris水迷宮和避暗實(shí)驗(yàn)來分析APP/PS-AnkG+/-模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。體外實(shí)驗(yàn),利用生物信息學(xué)方法,對人和小鼠的AnkG啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對分析,克隆小鼠AnkG啟動(dòng)子；將該片段克隆至熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3構(gòu)建真核表達(dá)載體；采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別與pRL-CMV共轉(zhuǎn)染至N2a細(xì)胞和293T細(xì)胞后,同時(shí)給予0,0.5及1mMol/L的VPA處理12h后,采用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光素酶報(bào)告基因的活性。 結(jié)果：成功構(gòu)建AnkG缺失小鼠。X-gal染色和IHC結(jié)果顯示AnkG在腦中分布廣泛,尤其是海馬和皮層；與WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠腦中的AnkG表達(dá)量明顯下降。AnkG+/-小鼠和WT小鼠的身長、體重、腦重及腦重/體重系數(shù)等指標(biāo)無明顯差別。行為學(xué)結(jié)果表明AnkG缺失小鼠具有明顯的焦慮和抑郁行為及認(rèn)知功能障礙：與WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在Rotarod中的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和耐力無明顯改變；在曠場邊緣區(qū)停留時(shí)間增加和中心區(qū)探究次數(shù)減少；在高架十字迷宮中入開臂總次數(shù)比例下降和開臂停留的時(shí)間比例減少；在明暗實(shí)驗(yàn)中入暗潛伏期縮短且在暗室停留時(shí)間增加等反應(yīng)其具有明顯的焦慮行為。與WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在曠場中的直立次數(shù)和理毛次數(shù)減少,而不動(dòng)時(shí)間增加；在糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)中其糖水偏嗜指數(shù)下降,這些均反應(yīng)AnkG+/-小鼠具有明顯的抑郁行為。與WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠在Morris水迷宮中訓(xùn)練期時(shí)找到平臺(tái)的潛伏期長,空間探索期時(shí)的平臺(tái)區(qū)運(yùn)動(dòng)距離,穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)及平臺(tái)區(qū)停留的時(shí)間都減少；在避暗實(shí)驗(yàn)中,入暗潛伏期縮短,暗室停留時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)均增加,這些提示AnkG+/-小鼠存在學(xué)習(xí)記憶能力的下降。Western blotting結(jié)果顯示：與WT小鼠相比,AnkG+/-小鼠海馬區(qū)與焦慮相關(guān)的蛋白：GABA-BR1和GABA-BR2表達(dá)下降；與抑郁相關(guān)的蛋白：GABRA1、GluRl和BDNF表達(dá)下降及與認(rèn)知相關(guān)的蛋白：GluR1和PSD-95表達(dá)下降,而NMDAR1無明顯改變。 6mo和12mo的APP/PS1小鼠腦中的AnkG和Ap在細(xì)胞外存在明顯的共定位。PCR結(jié)果顯示含有APP、PS1及GEO目的條帶者為APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠；2mo、4mo及8mo的敲除AnkG的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠,與其它各組小鼠相比其體重、腦重及腦重/體重系數(shù)均沒有差別；免疫組化結(jié)果顯示,在敲除AnkG的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠中,其腦組織中皮層和海馬CA1、齒狀回DG區(qū)域神經(jīng)元內(nèi)AnkG表達(dá)均明顯下降。2mo的APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠在新物體識別實(shí)驗(yàn)中的識別指數(shù)下降,Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中找到平臺(tái)的潛伏期增加,且空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)和停留時(shí)間均減少,避暗實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)、暗室停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離增加,而明室運(yùn)動(dòng)距離減少,而2mo的APP/PS1小鼠與WT小鼠相比各項(xiàng)檢測指標(biāo)均無差別；與WT小鼠相比,4mo和8mo時(shí)APP/PS1-AnkCG+/-模型小鼠和APP/PS1模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有明顯下降,而且與APP/PS1小鼠相比,4mo的APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠的明室停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)路程明顯減少,而暗室停留時(shí)間增加。以上結(jié)果提示APP/PS1-AnkG+/-模型小鼠存在明顯的認(rèn)知功能障礙,不僅出現(xiàn)的比APP/PS1小鼠早,且4mo的APP/PS1-AnkG+/"模型小鼠比APP/PS1小鼠更嚴(yán)重。 體外實(shí)驗(yàn)表明：酶切和測序鑒定均顯示AnkG啟動(dòng)子克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建成功；熒光素酶活性檢測顯示AnkG啟動(dòng)子在N2a和293T細(xì)胞中均有較高的轉(zhuǎn)錄活性；0.5mMol/L VPA處理N2a細(xì)胞和293T細(xì)胞12h后,熒光素酶活性都明顯上調(diào)。結(jié)論：本研究表明AnkG缺失小鼠具有明顯的焦慮和抑郁行為及認(rèn)知功能障礙。其可能通過降低腦內(nèi)GABA-BR1、GABA-BR2、GABRA1、GluR1、BDNF和PSD-95等蛋白,破壞遞質(zhì)的興奮性/抑制性平衡及突觸可塑性等,影響腦內(nèi)神經(jīng)回路,從而導(dǎo)致行為學(xué)的改變。與APP/PS1小鼠相比,AnkG缺失的APP/PS1小鼠在早期就出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙,同時(shí)這種認(rèn)知功能障礙隨著月齡的增加而顯著增加。AnkG對神經(jīng)系統(tǒng)起著重要的作用,且其可被VPA通過AnkG啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：焦慮 抑郁 認(rèn)知障礙 AnkG 阿爾茨海默病 丙戊酸鈉
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 第一部分 AnkG對小鼠精神行為和認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討12-80
• 中文摘要12-14
• Abstract14-17
• 前言17-35
• 材料和方法35-52
• 結(jié)果52-64
• 討論64-67
• 小結(jié)67-68
• 參考文獻(xiàn)68-80
• 第二部分 AnkG對APP/PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠的作用及機(jī)制研究80-119
• 中文摘要80-82
• Abstract82-84
• 前言84-92
• 材料和方法92-100
• 結(jié)果100-110
• 討論110-112
• 小結(jié)112-113
• 參考文獻(xiàn)113-119
• 第三部分 丙戊酸鈉對AnkG基因表達(dá)機(jī)制的研究119-148
• 中文摘要119-120
• Abstract120-121
• 前言121-128
• 材料和方法128-137
• 結(jié)果137-141
• 討論141-143
• 小結(jié)143-144
• 參考文獻(xiàn)144-148
• 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)148-149
• 縮略詞表149-150
• 個(gè)人簡歷150-151
• 致謝151-152

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本文編號：869852