本文關(guān)鍵詞：新型多功能他克林巰基衍生物ST09對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響及機制

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【摘要】：第一部分ST09設(shè)計合成、體外活性檢測及肝毒性評價 目的：血管性癡呆(vascular dementia, VaD)是一種嚴(yán)重威脅中老年人群身體健康和生活質(zhì)量的神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病。本課題組的前期研究采用多靶點配體(multi-target-directed ligands. MTDLs)的分子構(gòu)建策略,選用經(jīng)典藥物他克林(tacrine)作先導(dǎo)化合物,在保持乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)抑制活性的基礎(chǔ)上,引入巰基官能團,并制備成“前藥”形式,合成了一系列新的多功能化合物。本課題選擇其中效果最好的化合物ST09,繼續(xù)改進(jìn)其合成路線并初步評價其藥理毒理作用,探索其用于治療血管性癡呆的可能性。 方法：化學(xué)合成、核磁共振、質(zhì)譜分析、體外ChE活性篩選、體外細(xì)胞保護(hù)活性評價、類藥性分析、電子自旋共振技術(shù)、體內(nèi)肝毒性評價、HE染色。 結(jié)果：優(yōu)化他克林衍生物前藥分子ST09的合成方法,擴大合成量,總收率保持在50-60%,其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜解析得到確證。體外藥代動力學(xué)結(jié)果顯示,作為前藥分子的ST09經(jīng)全血孵育后,會迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槊撘阴；乃肆謳�基衍生物的形式(ST10),30min內(nèi)的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到96.72%。體外膽堿酯酶活性測試顯示,ST09和ST10都基本保留了母藥tacrine對AChE的抑制活性,對BuChE的抑制作用稍微減弱。PC12細(xì)胞活性實驗結(jié)果顯示1-30μM ST09對PC12細(xì)胞幾乎無細(xì)胞毒性,對H202誘導(dǎo)的氧化損傷具有較好的保護(hù)性。大鼠體內(nèi)肝毒性分析發(fā)現(xiàn),ST09給藥組(3.45mg/kg)大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase或glutamic-oxalacetic transaminase,AST/GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase或glutamic-pyruvic transaminase, ALT/GPT)水平與對照組無顯著差異,都處于正常值范圍；肝臟HE染色結(jié)果也與之一致,各組均未表現(xiàn)出肝細(xì)胞損傷。與同等摩爾濃度的tacrine相比,ST09不引起Hepg2細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的升高,且其脫乙酰基活性形式ST10具有顯著的體外自由基清除活性。通過Pallas3.3軟件分析ST09化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示ST09滿足lipinski類藥性五規(guī)則(rule of five, Ro5);而且該化合物具有良好的血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)透過性(TPSA值為71.09A2),能夠?qū)崿F(xiàn)中樞靶向性。 結(jié)論：相對于tacrine,前藥ST09及其活性體內(nèi)代謝產(chǎn)物ST10的乙酰膽堿酯酶抑制活性未發(fā)生顯著改變,但其抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性顯著增加,且對于肝臟細(xì)胞的毒性也明顯降低,說明巰基基團的引入產(chǎn)生了“增效減毒”的效果。 第二部分ST09對血管性癡呆大鼠認(rèn)知行為的影響 目的：VaD約占癡呆患者總數(shù)的20-30%,是因各種類型的腦血管病所致的認(rèn)知功能障礙而引起的獲得性智能損害綜合征。永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(permanent occlusion of bilateral common carotidarteries,2-VO)模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的研究VaD的建模方法之一。為評價他克林巰基衍生物ST09對VaD的治療效果,本課題觀察2-VO所致VaD模型大鼠行為學(xué)的改變以及大腦皮層和海馬病理學(xué)特征變化,研究他克林巰基衍生物ST09對VaD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶損傷的影響。 方法：選擇多奈哌齊(Don)作為陽性對照藥。將健康雄性大鼠隨機分為六組：假手術(shù)(Sham)組、模型組(Model+溶媒)、陽性對照組(Model+Don)、給藥組(Mode+-ST09低、中、高)三個劑量組。采用2-VO法致大鼠慢性前腦灌注不足,建立學(xué)習(xí)記憶損傷的血管性癡呆模型。術(shù)后1w開始每天腹腔給藥,Sham組和Model組給予生理鹽水,Don組給予0.30mg/kg/day, ST09低、中、高三個劑量組按1.73mg/kg/day,3.46mg/kg/day和6.92mg/kg/day,連續(xù)給藥6w后,進(jìn)行大鼠Morris水迷宮有關(guān)空間學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)檢測。應(yīng)用HE染色觀察皮層和海馬組織病理學(xué)改變。 結(jié)果：術(shù)后7w,在定位航行實驗中,Model組大鼠逃避潛伏期明顯長于Sham組[F(1,16)=25.251,P0.01]；與Model組相比,ST09中、高治療組大鼠潛伏期明顯縮短[F(1,25)=12.845,P0.001]。隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異[F(3,141)=82.902,P0.01]。在day×group交互影響中,結(jié)果顯示所設(shè)置的給藥方案隨著訓(xùn)練進(jìn)行具有顯著差異[F(15,141)=1.827,P=0.036]。在隱藏平臺后的第1d訓(xùn)練中,各組逃避潛伏期并無顯著性差異F(5,47)=0.576,P=0.718)。第2-4d,各組逃避潛伏期具有顯著性差異[day2:F(5,47)=4.967, P=0.001; day3:F(5,47)=6.670, P0.001;day4:F(5,47)=11.228,P0.001]。在訓(xùn)練第2-4d,與Model組相比,Sham組和ST09中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P0.01)；在第3-4d,ST09高劑量組大鼠逃避潛伏期也明顯縮短(P0.05)。與Model組相比,低劑量ST09組大鼠逃避潛伏期無顯著性差異。在空間探索實驗中,與Model組相比,Sham組大鼠在目標(biāo)象限的時間和路程均明顯延長(P0.05)；ST09中、高劑量組在目標(biāo)象限的時間均明顯延長(P0.05or0.01)；ST09中劑量組在目標(biāo)象限的路程明顯延長(P0.05)。HE染色結(jié)果顯示,Sham組大鼠皮層和海馬CAl區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊、形態(tài)完整,核仁清晰。Model組大鼠皮層和海馬腦區(qū)神經(jīng)元丟失,胞核固縮、濃染,出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤、膠質(zhì)細(xì)胞增生和血管增生。ST09治療組和Don組此類現(xiàn)象得到明顯改善。 結(jié)論：ST09對VaD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力有明顯改善作用,并且大鼠皮層和海馬組織病理學(xué)改變程度大大減輕,表明ST09對VaD具有治療作用。 第三部分ST09改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙的機制 目的：VaD患者認(rèn)知功能障礙與腦部缺血缺氧引起的膽堿能神經(jīng)功能損傷、氧化應(yīng)激增加和能量供應(yīng)不足都有密切關(guān)系。本課題通過觀察藥物對VaD模型大鼠海馬和皮層組織膽堿能系統(tǒng)損傷、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平和腦部葡萄糖代謝的影響,探討ST09治療VaD相關(guān)認(rèn)知障礙的作用機制。 方法：將經(jīng)2-VO造模、給藥和行為學(xué)測試后的SD大鼠斷頭處死,取血清及海馬、皮層組織。選取Sham組、模型組、陽性對照組和中劑量給藥組(3.46mg/kg)四組樣本做后續(xù)研究。血清、海馬和皮層組織勻漿液做抗氧化和氧化損傷指標(biāo)、蛋白巰基含量以及膽堿酯酶活性檢測。以Western Blotting檢測海馬和皮層凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bc1-2和活性Caspase-3表達(dá)。以小動物18F-FDG PET成像技術(shù)檢測四組SD大鼠(給藥6w后)進(jìn)行皮層和海馬腦區(qū)的葡萄糖代謝情況。 結(jié)果：給藥6w后,Model組大鼠海馬和皮層腦區(qū)SOD活性顯著低于Sham組,ST09(3.46mg/kg)組缺血損傷后的SOD活性得到顯著提高(P0.05vs model)。 Model組大鼠海馬和皮層MDA水平較Sham組顯著升高,而ST09(3.46mg/kg)組明顯逆轉(zhuǎn)了這兩個腦區(qū)的MDA增加(P0.01)。Model組大鼠血清、海馬和皮層蛋白巰基含量較Sham組顯著降低,ST09組則得到顯著改善(P0.01),并且ST09組血清和腦組織中蛋白巰基含量明顯高于陽性對照藥Don組(P0.01)。相對于Sham組,Model組大鼠皮層和海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值顯著降低,活性caspase3蛋白表達(dá)顯著升高。ST09(3.46mg/kg)明顯逆轉(zhuǎn)缺血損傷所致的凋亡改變,皮層Bc1-2/Bax表達(dá)從0.632±0.111增至1.697±0.131(P0.05),海馬從0.238±0.048增加到0.756±0.068(P0.01)；皮層區(qū)活性caspase-3表達(dá)水平從0.706±0.054降至0.475±0.042(P0.01),海馬從0.821±0.036降至0.483±0.076(P0.01)。小動物18F-FDGPET成像結(jié)果顯示,相對于對照組,模型組大鼠PET示蹤劑的分布顯著減少(P0.01),說明慢性腦缺血造成皮層和海馬組織葡萄糖代謝減少,而ST09組示蹤劑分布明顯增強(P0.05),并超過陽性對照藥Don組,提示ST09具有更好的腦代謝改善作用。 結(jié)論：ST09明顯改善VaD大鼠海馬和皮層的抗氧化、抗凋亡系統(tǒng)功能,保護(hù)腦部的氧化損傷和膽堿能系統(tǒng)損傷,同時還大大促進(jìn)缺血腦區(qū)葡萄糖代謝,增加了腦區(qū)的能量利用,這些因素共同參與該化合物對VaD大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的改善。以上結(jié)果提示,ST09具有潛在的抗VaD的臨床開發(fā)價值。
【關(guān)鍵詞】：血管性癡呆 膽堿酯酶 膽堿酯酶抑制劑 巰基化合物 細(xì)胞保護(hù) 他克林 多靶點配體 血管性癡呆 巰基他克林 Morris水迷宮 學(xué)習(xí)與記憶 膽堿酯酶活性 氧化損傷與抗氧能力 抗凋亡 葡萄糖代謝
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.13
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 前言17-21
• 第一部分 新型他克林巰基衍生物前藥分子ST09設(shè)計合成、體外活性檢測及肝毒性評價21-46
• 1 材料與方法21-33
• 2 結(jié)果33-41
• 3 討論41-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第二部分 ST09對血管性癡呆大鼠認(rèn)知行為的影響46-57
• 1 材料與方法46-49
• 2 結(jié)果49-53
• 3 討論53-55
• 4 小結(jié)55-57
• 第三部分 ST09改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知障礙的機制57-76
• 1 材料與方法57-65
• 2 結(jié)果65-70
• 3 討論70-74
• 4 小結(jié)74-76
• 全文總結(jié)76-78
• 本文創(chuàng)新點78
• 展望78-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 綜述85-112
• 參考文獻(xiàn)106-112
• 附錄 攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文112-113
• 致謝113-114

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：863663