本文關(guān)鍵詞：ALDH2在β淀粉樣蛋白致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

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【摘要】：隨著全球進(jìn)入老齡化社會的進(jìn)程加快,阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)這一嚴(yán)重威脅老年人體健康的神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率、病死率也呈逐年上升的態(tài)勢,給社會和家庭造成沉重負(fù)擔(dān)。然而,臨床上對AD的有效治療手段十分欠缺,療效很有限。究其原因,主要是缺乏對AD發(fā)病機(jī)制的深入理解和針對其治療靶點的新型治療劑。β淀粉樣蛋白(Aβ)是AD神經(jīng)元病理改變神經(jīng)炎性斑塊的主要組成成分和元兇。在腦內(nèi)由淀粉樣前體蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的β-裂解酶作用下生成。目前的研究認(rèn)為,腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外重要細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Aβ沉積和腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)膜Aβ沉積可能是AD致病的核心機(jī)制,Aβ已成為治療AD的重要靶點之一。線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2),是乙醛脫氫酶家族中的一員,是核編碼的線粒體酶,進(jìn)化保守,在機(jī)體各個器官廣泛表達(dá)。其主要功能為將酒精代謝過程中產(chǎn)生的乙醛脫氫生成乙酸,從而降低許多酒精相關(guān)性疾病的風(fēng)險。其次,ALDH2具有硝酸鹽還原酶的作用,能將硝酸酯類藥物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的一氧化氮,以此降低冠心病死亡風(fēng)險。更為重要的是,近年的研究發(fā)現(xiàn),ALDH2因其能夠直接、間接轉(zhuǎn)化機(jī)體各組織器官、細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的細(xì)胞毒性反應(yīng)性醛類等物質(zhì),具有顯著的細(xì)胞保護(hù)作用,且與多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病相關(guān)。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果亦顯示,aldh2基因缺失型人群阿爾茨海默病患病率明顯增高;動物實驗結(jié)果顯示,aldh2基因敲除小鼠更易遭受氧化應(yīng)激損傷,表現(xiàn)出增齡相關(guān)性神經(jīng)退行性病理改變及記憶力喪失等一系列神經(jīng)功能障礙;細(xì)胞水平實驗顯示,在原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元中過表達(dá)aldh2可有效減少代謝產(chǎn)物4羥基壬荃導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)及線粒體損傷。然而,aldh2在aβ所致的神經(jīng)元損傷中起到什么作用?其機(jī)制是什么?既然aldh2突變能增加患ad的危險性,使用aldh2激活劑alda-1是否能夠保護(hù)aβ所致的神經(jīng)元損傷?目前未見相關(guān)報道。研究目的:探索aldh2在ad神經(jīng)元病理損傷中的作用,并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。為其作為ad病因治療嶄新靶點提供實驗依據(jù)。研究方法:使用聚集態(tài)的aβ50?mol/l處理ht22細(xì)胞即小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系,構(gòu)建ad細(xì)胞模型,并在此基礎(chǔ)上使用aldh2特異性激活劑alda-1,aldh2特異性抑制劑daidzin。以mtt實驗檢測細(xì)胞生存率、流式細(xì)胞術(shù)及tunel檢測細(xì)胞凋亡率。western-bolt檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3、bcl2等。原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化ad細(xì)胞模型上進(jìn)行干預(yù),經(jīng)10%胎牛血清誘導(dǎo)分化5天后加入aβ25-3550?mol/l、aldh2激活劑alda-150?mol/l、aldh2抑制劑daidzin60?mol/l,觀察分化的克隆球形態(tài)和神經(jīng)元數(shù)目,進(jìn)一步證明aldh2神經(jīng)元保護(hù)作用。使用透射電鏡檢測細(xì)胞線粒體形態(tài)、超氧陰離子熒光探針檢測ros水平、elisa檢測4-hne水平、熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)atp含量。實驗結(jié)果:mtt實驗顯示aβ50?mol/l處理24小時后細(xì)胞生存率顯著降低。在aβ所致ad細(xì)胞模型基礎(chǔ)上加入aldh2激活劑alda-1,aldh2抑制劑daidzin。結(jié)果顯示:加入alda-150?mol/l時細(xì)胞生存率明顯上升,而使用daidzin60?mol/l時抑制aldh2活性細(xì)胞生存率明顯下降,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與aβ處理組相比加入aldh2激活劑alda-150?mol/l后細(xì)胞凋亡率明顯降低,使用aldh2抑制劑daidzin后細(xì)胞凋亡率無明顯變化。western-bolt結(jié)果顯示加入aldh2激活劑alda-150?mol/l后細(xì)胞內(nèi)caspase3active含量顯著減少,bcl2含量顯著增加,與aβ處理組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。tunel染色后熒光顯微鏡觀察加入alda-1后綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞明顯減少。原代小鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化實驗結(jié)果顯示,Aβ處理組分化的克隆球形態(tài)異常、細(xì)胞數(shù)目減少。而ALDH2激活后分化克隆球形態(tài)較為正常,細(xì)胞數(shù)目增多。透射電鏡結(jié)果顯示:與正常對照組相比,Aβ處理組的線粒體存在空泡以及膜破裂而加入Alda-1后線粒體形態(tài)基本恢復(fù)正常。使用DHE熒光探針檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS含量,結(jié)果顯示與Aβ處理組加入ALDH2激活劑Alda—1后ROS熒光強(qiáng)度呈顯著下降。Elisa檢測4-HNE水平,與Aβ處理組相比加入ALDH2激活劑Alda—1后能顯著減少細(xì)胞內(nèi)4-HNE含量。使用熒光素酶法檢測細(xì)胞內(nèi)的ATP含量,與Aβ處理組相比加入ALDH2激活劑Alda—1后細(xì)胞內(nèi)ATP顯著升高。綜上所述ALDH2激活能保護(hù)神經(jīng)元免受Aβ所致?lián)p傷,其可能的機(jī)制為:ALDH2可減輕Aβ的線粒體毒性作用,減少ROS、4-HNE的產(chǎn)生,增加線粒體內(nèi)的ATP含量。實驗結(jié)論:1.Alda-1激活A(yù)LDH2能減輕Aβ所致的HT22細(xì)胞生存率降低,Caspase3表達(dá)的減少、Bcl2的表達(dá)增加,提示ALDH2保護(hù)Aβ所致的神經(jīng)元損傷。2.神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化在模擬腦內(nèi)AD細(xì)胞環(huán)境下,Aβ所致的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常,在應(yīng)用Alda-1后得以恢復(fù),從另一方面證實了ALDH2的神經(jīng)元保護(hù)作用。3.ALDH2神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制之一可能為,減少Aβ產(chǎn)生的ROS和毒性醛類造成的線粒體損傷,增加ATP的產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 線粒體乙醛脫氫酶2 β淀粉樣蛋白
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-22
• 一、阿爾茨海默病研究現(xiàn)狀及相關(guān)機(jī)制15-18
• 二.ALDH2 研究現(xiàn)狀18-22
• 第一部分：ALDH2對?淀粉樣蛋白致神經(jīng)元損傷的細(xì)胞保護(hù)作用22-35
• 引言22
• 1 材料22-24
• 2 實驗方法24-26
• 3 實驗結(jié)果26-33
• 4 討論33-35
• 第二部分：ALDH2對AD病理環(huán)境原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用35-41
• 引言35
• 1 材料35-36
• 2 實驗方法36-37
• 3 實驗結(jié)果37-40
• 4 討論40-41
• 第三部分：ALDH2神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制研究41-49
• 引言41
• 1 材料41
• 2 實驗方法41-43
• 3 實驗結(jié)果43-47
• 4 討論47-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-58
• 個人簡歷和研究成果58-59
• 致謝59

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本文編號：853014