本文關(guān)鍵詞：小膠質(zhì)細(xì)胞乳鐵蛋白的表達(dá)及其對腹側(cè)中腦神經(jīng)元的作用研究

  更多相關(guān)文章： 帕金森病 小膠質(zhì)細(xì)胞 鐵 MPP~+ 乳鐵蛋白

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動減少和姿勢反射障礙等癥狀。PD的神經(jīng)病理學(xué)基礎(chǔ)是黑質(zhì)致密帶(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元的變性脫失以及由此而導(dǎo)致的紋狀體DA含量降低。PD的病因目前尚未完全明了,與遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、興奮性毒素、自身免疫、黑質(zhì)(substantia nigra, SN)鐵聚積和細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)。PD患者的中腦SNpc有大量的激活的小膠質(zhì)細(xì)胞,這些激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和殘存的DA能神經(jīng)元又有大量的鐵沉積,然而小膠質(zhì)細(xì)胞激活和鐵聚積之間的關(guān)系尚未闡明。 乳鐵蛋白(lactoferrin, Lf)是一種鐵結(jié)合性糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員之一,由許多外分泌腺分泌,存在于人類和其他哺乳動物的淚液、唾液、乳汁和嗜中性粒細(xì)胞中。乳鐵蛋白受體(lactoferrin receptor, LfR)廣泛存在于人體內(nèi)的不同組織和細(xì)胞類型中,其作用是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞參與Lf內(nèi)化。Lf可以結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)三價鐵離子,是鐵在機(jī)體內(nèi)代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵載體。Lf還具有廣泛的生物學(xué)功能：抗氧化應(yīng)激,抗癌,調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)等,可能與其鐵結(jié)合特性無關(guān)。在體內(nèi)Lf主要以兩種形式存在：不含鐵形式(apo-lactoferrin, apo-Lf)和鐵飽和形式(holo-lactoferrin, holo-Lf)。在腦內(nèi)只有激活的小膠質(zhì)細(xì)胞合成釋放Lf,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)模型小鼠中Lf mRNA的表達(dá)水平升高。LfR主要在神經(jīng)元上表達(dá),腦組織染色發(fā)現(xiàn)PD患者中腦的神經(jīng)元和微血管中LfR反應(yīng)性表達(dá)增加,提示Lf/LfR與PD鐵聚積和神經(jīng)元進(jìn)行性退化之間有一定關(guān)聯(lián)性。 本研究應(yīng)用原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞、腹側(cè)中腦神經(jīng)元及神經(jīng)毒素MPTP制備的PD小鼠模型,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗、實時熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀技術(shù)、免疫熒光、免疫印跡、高效液相色譜法、激光共聚焦掃描技術(shù)等多項研究方法,探討了鐵對激活的小膠質(zhì)細(xì)胞合成釋放Lf的影響以及Lf對神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)損傷的腹側(cè)中腦神經(jīng)元及MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。結(jié)果如下： 1.100μmol/L MPP+或800ng/ml的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞24h,Lf的釋放量顯著增加(P0.05)。100μmol/L的枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate, FAC)預(yù)處理12h可顯著增加其釋放量,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.100μmol/L FAC預(yù)孵育12h后,分別加入100μmol/L MPP+或800ng/ml LPS處理24h,小膠質(zhì)細(xì)胞中Lf mRNA的表達(dá)明顯升高,與對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經(jīng)元24h后,細(xì)胞線粒體跨膜電位差(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)明顯降低,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預(yù)處理4h后,可明顯拮抗MPP+引起的△Ψm降低(P0.05)。 4.100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf處理原代培養(yǎng)的VM神經(jīng)元24h, LfR的蛋白表達(dá)水平顯著增高,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5.LfR抗體封閉1h可以明顯阻斷Lf的神經(jīng)保護(hù)作用(P0.05)。 6.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經(jīng)元24h后,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)蛋白水平下調(diào),與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預(yù)處理后,可明顯拮抗MPP+引起的SOD蛋白水平下調(diào),與單純MPP+組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 7.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經(jīng)元24h后,細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白水平下調(diào),與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；而100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預(yù)處理后,可明顯拮抗MPP+引起的Bcl-2蛋白水平下調(diào),Bcl-2/Bax比值升高,與單純MPP+組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 8.100ng/ml apo-Lf處理后可明顯降低原代培養(yǎng)的VM神經(jīng)元內(nèi)可變鐵池(labile iron pool, LIP)的水平,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而holo-Lf處理后未檢測到此變化。 9. MPTP可明顯減少C57BL/6小鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶免疫陽性(TH-IR)神經(jīng)元數(shù)目,apo-Lf預(yù)保護(hù)可顯著增加TH-IR神經(jīng)元數(shù)目(P0.05)。 10.Lf預(yù)保護(hù)可明顯對抗MPTP對小鼠紋狀體DA含量的降低作用,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 上述結(jié)果表明,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可合成釋放大量的Lf,這一過程可以被細(xì)胞內(nèi)的高鐵狀態(tài)增強(qiáng)。在原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦神經(jīng)元中,Lf可明顯拮抗MPP+引起的細(xì)胞△Ψm的降低,上調(diào)SOD和抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的作用；apo-Lf還具有鐵螫合能力,從而對抗MPP+的損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠中TH-IR神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA的含量明顯降低,而經(jīng)Lf預(yù)處理以后可明顯拮抗上述變化。本實驗通過研究Lf合成釋放的影響因素及其神經(jīng)保護(hù)作用,為PD的發(fā)病和防治提供了實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 小膠質(zhì)細(xì)胞 鐵 MPP~+ 乳鐵蛋白
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 材料和方法12-29
• 1. 腹側(cè)中腦神經(jīng)元的原代培養(yǎng)12-13
• 2. 小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)13-15
• 3. 免疫熒光方法鑒定腹側(cè)中腦神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的純度15-16
• 4. 小膠質(zhì)細(xì)胞釋放Lf含量的檢測16-18
• 5 小膠質(zhì)細(xì)胞Lf mRNA的表達(dá)變化18-20
• 6. Lf對MPP~+處理的VM神經(jīng)元線粒體跨膜電位(△Ψm)的影響20-21
• 7. Lf處理后VM神經(jīng)元LfR、SOD、Bcl-2、Bax蛋白水平的表達(dá)變化21-24
• 8. LfR封閉后Lf對MPP~+處理的VM神經(jīng)元△Ψm的影響24-25
• 9. Lf處理后細(xì)胞內(nèi)可變鐵池(Labile iron pool,LIP)的測定25-26
• 10. 實驗動物及動物分組26
• 11. 免疫熒光方法檢測小鼠黑質(zhì)TH的表達(dá)變化26-27
• 12. 高效液相色譜法檢測小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量27-28
• 13. 統(tǒng)計學(xué)處理28-29
• 結(jié)果29-41
• 1. 免疫熒光技術(shù)鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的純度29-30
• 2. 鐵對MPP~+或LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放乳鐵蛋白含量的影響30
• 3. 鐵對MPP~+或LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中Lf mRNA表達(dá)水平的影響30-31
• 4. Lf可以明顯阻斷MPP~+誘導(dǎo)的VM神經(jīng)元△Ψm的降低31-32
• 5. Lf可以上調(diào)VM神經(jīng)元內(nèi)LfR的蛋白表達(dá)水平32-33
• 6. LfR封閉可以明顯抑制Lf對VM神經(jīng)元的保護(hù)作用33-34
• 7. Lf預(yù)處理可以上調(diào)VM神經(jīng)元內(nèi)SOD的蛋白表達(dá)水平34-35
• 8. Lf對VM神經(jīng)元中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的影響35-36
• 9. Apo-Lf可顯著降低VM神經(jīng)元內(nèi)LIP的水平36-37
• 10. Lf對PD模型小鼠黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量的影響37-39
• 11. Lf對PD模型小鼠紋狀體多巴胺含量的影響39-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-46
• 綜述46-60
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果60-61
• 縮略詞表61-63
• 致謝63-64

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