發(fā)布時間：2017-09-14 00:28

  本文關鍵詞：小膠質細胞乳鐵蛋白的表達及其對腹側中腦神經元的作用研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種常見的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,臨床表現主要有靜止性震顫、肌僵直、運動減少和姿勢反射障礙等癥狀。PD的神經病理學基礎是黑質致密帶(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(dopamine, DA)能神經元的變性脫失以及由此而導致的紋狀體DA含量降低。PD的病因目前尚未完全明了,與遺傳因素、環(huán)境因素、氧化應激、興奮性毒素、自身免疫、黑質(substantia nigra, SN)鐵聚積和細胞凋亡等多種因素有關。PD患者的中腦SNpc有大量的激活的小膠質細胞,這些激活的小膠質細胞和殘存的DA能神經元又有大量的鐵沉積,然而小膠質細胞激活和鐵聚積之間的關系尚未闡明。 乳鐵蛋白(lactoferrin, Lf)是一種鐵結合性糖蛋白,屬于轉鐵蛋白家族成員之一,由許多外分泌腺分泌,存在于人類和其他哺乳動物的淚液、唾液、乳汁和嗜中性粒細胞中。乳鐵蛋白受體(lactoferrin receptor, LfR)廣泛存在于人體內的不同組織和細胞類型中,其作用是通過受體介導的內吞參與Lf內化。Lf可以結合轉運三價鐵離子,是鐵在機體內代謝及轉運的關鍵載體。Lf還具有廣泛的生物學功能：抗氧化應激,抗癌,調控免疫炎癥反應等,可能與其鐵結合特性無關。在體內Lf主要以兩種形式存在：不含鐵形式(apo-lactoferrin, apo-Lf)和鐵飽和形式(holo-lactoferrin, holo-Lf)。在腦內只有激活的小膠質細胞合成釋放Lf,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)模型小鼠中Lf mRNA的表達水平升高。LfR主要在神經元上表達,腦組織染色發(fā)現PD患者中腦的神經元和微血管中LfR反應性表達增加,提示Lf/LfR與PD鐵聚積和神經元進行性退化之間有一定關聯性。 本研究應用原代培養(yǎng)的大鼠小膠質細胞、腹側中腦神經元及神經毒素MPTP制備的PD小鼠模型,采用酶聯免疫吸附實驗、實時熒光定量PCR、流式細胞儀技術、免疫熒光、免疫印跡、高效液相色譜法、激光共聚焦掃描技術等多項研究方法,探討了鐵對激活的小膠質細胞合成釋放Lf的影響以及Lf對神經毒素1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)損傷的腹側中腦神經元及MPTP誘導的PD模型小鼠發(fā)揮保護作用的可能機制。結果如下： 1.100μmol/L MPP+或800ng/ml的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理原代培養(yǎng)的小膠質細胞24h,Lf的釋放量顯著增加(P0.05)。100μmol/L的枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate, FAC)預處理12h可顯著增加其釋放量,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.100μmol/L FAC預孵育12h后,分別加入100μmol/L MPP+或800ng/ml LPS處理24h,小膠質細胞中Lf mRNA的表達明顯升高,與對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經元24h后,細胞線粒體跨膜電位差(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)明顯降低,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預處理4h后,可明顯拮抗MPP+引起的△Ψm降低(P0.05)。 4.100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf處理原代培養(yǎng)的VM神經元24h, LfR的蛋白表達水平顯著增高,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.LfR抗體封閉1h可以明顯阻斷Lf的神經保護作用(P0.05)。 6.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經元24h后,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)蛋白水平下調,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)；100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預處理后,可明顯拮抗MPP+引起的SOD蛋白水平下調,與單純MPP+組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 7.100μmol/L MPP+處理原代培養(yǎng)的VM神經元24h后,細胞內Bcl-2蛋白水平下調,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)；而100ng/ml apo-Lf和100ng/ml holo-Lf預處理后,可明顯拮抗MPP+引起的Bcl-2蛋白水平下調,Bcl-2/Bax比值升高,與單純MPP+組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 8.100ng/ml apo-Lf處理后可明顯降低原代培養(yǎng)的VM神經元內可變鐵池(labile iron pool, LIP)的水平,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05),而holo-Lf處理后未檢測到此變化。 9. MPTP可明顯減少C57BL/6小鼠黑質中酪氨酸羥化酶免疫陽性(TH-IR)神經元數目,apo-Lf預保護可顯著增加TH-IR神經元數目(P0.05)。 10.Lf預保護可明顯對抗MPTP對小鼠紋狀體DA含量的降低作用,與正常對照組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 上述結果表明,激活的小膠質細胞可合成釋放大量的Lf,這一過程可以被細胞內的高鐵狀態(tài)增強。在原代培養(yǎng)的腹側中腦神經元中,Lf可明顯拮抗MPP+引起的細胞△Ψm的降低,上調SOD和抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達水平,從而發(fā)揮抗氧化應激和抗凋亡的作用；apo-Lf還具有鐵螫合能力,從而對抗MPP+的損傷發(fā)揮神經保護作用。MPTP誘導的PD模型小鼠中TH-IR神經元數目顯著減少,DA及其代謝產物DOPAC、HVA的含量明顯降低,而經Lf預處理以后可明顯拮抗上述變化。本實驗通過研究Lf合成釋放的影響因素及其神經保護作用,為PD的發(fā)病和防治提供了實驗依據。
【關鍵詞】：帕金森病 小膠質細胞 鐵 MPP~+ 乳鐵蛋白
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 材料和方法12-29
• 1. 腹側中腦神經元的原代培養(yǎng)12-13
• 2. 小膠質細胞的原代培養(yǎng)13-15
• 3. 免疫熒光方法鑒定腹側中腦神經元和小膠質細胞的純度15-16
• 4. 小膠質細胞釋放Lf含量的檢測16-18
• 5 小膠質細胞Lf mRNA的表達變化18-20
• 6. Lf對MPP~+處理的VM神經元線粒體跨膜電位(△Ψm)的影響20-21
• 7. Lf處理后VM神經元LfR、SOD、Bcl-2、Bax蛋白水平的表達變化21-24
• 8. LfR封閉后Lf對MPP~+處理的VM神經元△Ψm的影響24-25
• 9. Lf處理后細胞內可變鐵池(Labile iron pool,LIP)的測定25-26
• 10. 實驗動物及動物分組26
• 11. 免疫熒光方法檢測小鼠黑質TH的表達變化26-27
• 12. 高效液相色譜法檢測小鼠紋狀體內多巴胺含量27-28
• 13. 統(tǒng)計學處理28-29
• 結果29-41
• 1. 免疫熒光技術鑒定原代培養(yǎng)的神經元和小膠質細胞的純度29-30
• 2. 鐵對MPP~+或LPS激活的小膠質細胞釋放乳鐵蛋白含量的影響30
• 3. 鐵對MPP~+或LPS激活的小膠質細胞中Lf mRNA表達水平的影響30-31
• 4. Lf可以明顯阻斷MPP~+誘導的VM神經元△Ψm的降低31-32
• 5. Lf可以上調VM神經元內LfR的蛋白表達水平32-33
• 6. LfR封閉可以明顯抑制Lf對VM神經元的保護作用33-34
• 7. Lf預處理可以上調VM神經元內SOD的蛋白表達水平34-35
• 8. Lf對VM神經元中Bcl-2、Bax蛋白表達水平的影響35-36
• 9. Apo-Lf可顯著降低VM神經元內LIP的水平36-37
• 10. Lf對PD模型小鼠黑質TH陽性神經元數量的影響37-39
• 11. Lf對PD模型小鼠紋狀體多巴胺含量的影響39-41
• 討論41-44
• 結論44-45
• 參考文獻45-46
• 綜述46-60
• 參考文獻55-60
• 攻讀學位期間的研究成果60-61
• 縮略詞表61-63
• 致謝63-64

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本文編號：846796