本文關(guān)鍵詞：Apicidin對(duì)ADAM10的調(diào)控及其對(duì)阿爾茨海默病治療的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默 ADAM10 apicidin SP1 USF1

【摘要】：研究目的:中藥單體小分子高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶抑制劑apicidin可顯著增高pGL4.17-ADAM10的熒光素酶活性表達(dá)。故本研究旨在(1)在離體細(xì)胞中驗(yàn)證apicidin促進(jìn)ADAM10表達(dá);(2)研究apicidin促進(jìn)ADAM10表達(dá)的基因調(diào)控元件和信號(hào)通路;(3)開發(fā)擁有我國(guó)自主產(chǎn)權(quán)的中藥單體藥物,進(jìn)而為治療AD提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法及結(jié)果:1.藥物篩選及細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)apicidin對(duì)ADAM10有促進(jìn)作用。通過(guò)分子克隆構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pGL4.17-ADAM10熒光素酶報(bào)告基因的SH-SY5Y細(xì)胞系,并進(jìn)行中藥單體小分子高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn),組蛋白去乙�；敢种苿゛picidin可顯著增高pGL4.17-ADAM10的熒光素酶活性表達(dá)。在人胚胎腎細(xì)胞HEK293中,通過(guò)細(xì)胞活力測(cè)試、實(shí)時(shí)定量PCR及免疫印跡分析,研究apicidin的細(xì)胞毒性,及其對(duì)ADAM10的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。結(jié)果證實(shí)apicidin對(duì)ADAM10的轉(zhuǎn)錄和翻譯具有促進(jìn)作用。2.研究apicidin對(duì)ADAM10的作用調(diào)控元件。通過(guò)對(duì)ADAM10核心啟動(dòng)子區(qū)分析,用分子克隆的方法將其5個(gè)截短片段分別與pGL4.17連接,構(gòu)建pGL4.17-ADAM10-C/D/E/E1/E2熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24h后,加0.25uM的apicidin處理24h,用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同截短片段的HEK293細(xì)胞中熒光素酶活性的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了pGL4.17-ADAM10-E片段的細(xì)胞在apicidin處理后,與其他截短片段相比熒光素酶活性最強(qiáng)。查閱文獻(xiàn)及對(duì)ADAM10-E片段的分析發(fā)現(xiàn),此片段上主要存在有SP1及USF1兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)驗(yàn)證了SP1、USF1與ADAM10啟動(dòng)子區(qū)的相互作用。再用RNA干擾技術(shù)下調(diào)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中SP1與USF1的表達(dá),在此基礎(chǔ)上驗(yàn)證apicidin對(duì)ADAM10的促進(jìn)作用是否存在,結(jié)果發(fā)現(xiàn):USF1下調(diào)后,apicidin對(duì)ADAM10的促進(jìn)作用基本消失,而下調(diào)SP1后,apicidin仍輕度的增加了ADAM10的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證了apicidin對(duì)ADAM10的促進(jìn)作用主要通過(guò)影響USF1的活性產(chǎn)生。3.在SH-SY5Y細(xì)胞中研究apicidin對(duì)ADAM10調(diào)控的信號(hào)通路。通過(guò)免疫印跡分析,研究蛋白激酶C(PKC)抑制劑Calphostin C、蛋白激酶A抑制劑(PKA)H89、ERK途徑抑制劑U0126、PI3K抑制劑LY294002、SP1抑制劑Mithramycin A及胰島素對(duì)apicidin促進(jìn)ADAM10表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)抑制了ERK及SP1后,apicidin對(duì)ADAM10的促進(jìn)作用明顯下調(diào)。4.apicidin對(duì)BACE1及APP降解途徑的影響。通過(guò)熒光定量PCR及免疫印跡分析,加0.25uM的apicidin處理SH-SY5Y細(xì)胞48h后,檢測(cè)BACE1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組(等體積DMSO處理SH-SY5Y48h)相比,apicidin對(duì)BACE1的mRNA及蛋白水平均沒(méi)有影響。將0.25uM的apicidin處理HEK-APP細(xì)胞48h后,用免疫印跡技術(shù)分析apicidin對(duì)APP降解途徑的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比,apicidin處理后,APP表達(dá)未見(jiàn)明顯變化,而α-CTF蛋白表達(dá)增多,β-CTF蛋白表達(dá)減少。研究結(jié)論:綜上可知,組蛋白去乙�；敢种苿゛picidin可使ADAM10的表達(dá)上調(diào),而此種作用可能主要通過(guò)ERK信號(hào)通路對(duì)USF1的活力進(jìn)行調(diào)控產(chǎn)生的。同時(shí),表達(dá)上調(diào)的ADAM10通過(guò)促進(jìn)APP向非Aβ途徑降解,減少了毒性Aβ的生成。因此,apicidin作為新的調(diào)控ADAM10表達(dá)的小分子藥物,或有望成為治療AD的有效策略。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默 ADAM10 apicidin SP1 USF1
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 1 材料與方法15-42
• 1.1 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因p GL4.17-ADAM10質(zhì)粒的構(gòu)建15-20
• 1.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞系構(gòu)建20-24
• 1.3 藥物處理24-26
• 1.4 細(xì)胞活力測(cè)定26-27
• 1.5 報(bào)告基因熒光素酶活性分析27
• 1.6 熒光定量PCR分析（q PCR）27-31
• 1.7 蛋白印跡（WB）31-34
• 1.8 染色質(zhì)免疫共沉淀（CHIP）34-38
• 1.9 慢病毒細(xì)胞感染與si RNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染38-41
• 1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析41-42
• 2 結(jié)果42-45
• 2.1 在SH-SY5Y細(xì)胞中apicidin參與調(diào)節(jié)ADAM10的表達(dá)42
• 2.2 apicidin上調(diào)了HEK293細(xì)胞中ADAM10的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平42
• 2.3 apicidin對(duì)ADAM10的 調(diào)控位點(diǎn)主要在ADAM10啟 動(dòng)子區(qū)-508—-300 處42-43
• 2.4 apicidin主要通過(guò)影響USF1活性調(diào)控ADAM10表達(dá)43-44
• 2.5 apicidin通過(guò)ERK信號(hào)通路調(diào)控ADAM1044-45
• 2.6 apicidin通過(guò)增加ADAM10表達(dá)抑制APP向毒性Aβ 途徑降解45
• 3 討論45-48
• 4 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 附圖56-63
• 文獻(xiàn)綜述63-78
• 參考文獻(xiàn)70-78
• 致謝78-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文79

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 錢宏美;張亞男;李俊生;;ADAM9與惡性腫瘤[J];腫瘤防治研究;2009年11期

2 凌家艷;沈霖;劉慶;薛莎;馬威;吳輝;李子希;朱銳;;Changes in Platelet GPIbα and ADAM17 during the Acute Stage of Atherosclerotic Ischemic Stroke among Chinese[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年03期

3 蔡靜莉,楊凌峰,王蓉;ADAM家族研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));2000年04期

4 ;ADAM17 mRNA expression and pathological features of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2004年18期

5 Shintani Y;Higashiyama S;Ohta M;Hirabayashi H;Yamamoto S;Yoshimasu T;Matsuda H;Matsuura N;;Overexpression of ADAM9 in non-small cell lung cancer correlates with brain metastasis[J];中國(guó)神經(jīng)腫瘤雜志;2004年02期

6 喬純忠;卞倩;戚宇華;焦永軍;李俊生;;ADAM9基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年03期

7 關(guān)艷;鄺曉聰;姚金光;黃敏;;ADAM10在舌癌中的表達(dá)及其意義[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2011年11期

8 ;Role of ADAM10 and ADAM17 in CD16b Shedding Mediated by Different Stimulators[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年02期

9 劉爽;馬榮;;ADAM17在惡性腫瘤中的研究及其進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年17期

10 劉傳文;陳飛鵬;鄔勇堅(jiān);陽(yáng)雋;;ADAM10在肺癌中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 陳勤;蒙凌華;丁健;;ADAM15蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及其機(jī)理研究[A];2007醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

2 戴潔;劉真權(quán);黃志紓;;小分子結(jié)合ADAM10基因5′-UTR區(qū)富G序列對(duì)蛋白表達(dá)的影響[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集——第22分會(huì)：化學(xué)生物學(xué)[C];2014年

3 J.Norman Balfour-McKie;;IL10,IL4和PMA對(duì)U937細(xì)胞系A(chǔ)DAM表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(英文)[A];生命科學(xué)與生物技術(shù)：中國(guó)科協(xié)第三屆青年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];1998年

4 陳俊;段翼遠(yuǎn);龍皎月;張海龍;蔣雪梅;林峰;龍曉茹;劉恩梅;Joerg Bartsch;鄧林紅;;ADAM8肽抑制劑對(duì)氣道高反應(yīng)性等的抑制作用研究[A];第十屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨第十二屆全國(guó)生物流變學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2012年

5 孫慶玲;;ADAM-4000在QCS生料質(zhì)量控制系統(tǒng)中的應(yīng)用[A];水泥生料質(zhì)量控制應(yīng)用技術(shù)研討會(huì)交流會(huì)論文集[C];2006年

6 劉暉暉;;基于ADAM模塊的核設(shè)施監(jiān)測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)[A];第十七屆全國(guó)測(cè)控計(jì)量?jī)x器儀表學(xué)術(shù)年會(huì)（MCMI'2007）論文集（上冊(cè)）[C];2007年

7 劉曉麗;張龍舉;;COPD患者血清ADAM-17和趨化因子FKN的變化和意義[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 宋家雨;惠普ADAM“坐診”也“巡診”[N];網(wǎng)絡(luò)世界;2007年

2 倪洪章;惠普ADAM解決方案為企業(yè)數(shù)據(jù)“體檢”[N];計(jì)算機(jī)世界;2007年

3 汪蔚;用ADAM給信息系統(tǒng)體檢[N];中國(guó)計(jì)算機(jī)報(bào);2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 郭震;ADAM-17在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及靶向抑制ADAM-17對(duì)腎癌Notch通路的特異性影響以及分子機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2015年

2 常亮;RNA干擾介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌ADAM9和Stat3基因沉默的研究[D];吉林大學(xué);2016年

3 馬波;ADAM10在食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2015年

4 潘源;ADAM10參與垂體腺瘤海綿竇侵襲性行為的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

5 趙征;牙胚發(fā)育中ADAM28基因的克隆、表達(dá)和功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 吳靜;重組人ADAM15去整合素結(jié)構(gòu)域蛋白的制備及其作用機(jī)理[D];江南大學(xué);2008年

7 遲翔宇;ADAM33基因在支氣管哮喘發(fā)病中的研究[D];山東大學(xué);2011年

8 陳操;克—雅病患者腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)分析及朊病毒感染中ADAM10變化的研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2014年

9 房文錚;FoxM1調(diào)控ADAM17促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

10 龔理;發(fā)展“快”、“慢”COPD患者中醫(yī)體質(zhì)、Th17/Treg平衡及ADAM33基因多態(tài)性差異研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳麗君;缺氧條件下沉默ADAM17基因?qū)θ巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞增殖的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 丁華;轉(zhuǎn)染ADAM17-shRNA的BMSC對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

3 張媛媛;缺氧條件下ADAM17-shRNA對(duì)人MCF-7乳腺癌細(xì)胞侵襲力和遷移力的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

4 牛軍偉;ADAM17介導(dǎo)的CD163表達(dá)調(diào)控對(duì)PRRSV感染的影響[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

5 郝娥娥;ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性研究[D];石河子大學(xué);2015年

6 李擎瑜;探索ADAM17在小鼠大腦皮層發(fā)育中對(duì)細(xì)胞遷移和分化作用的分子機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 馬f，

本文編號(hào)：834868