本文關(guān)鍵詞：高糖高脂膳食所致的IETM誘發(fā)SAD的探討

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【摘要】：第一部分高糖高脂膳食所致的IETM誘發(fā)大鼠MS目的:探討高糖高脂膳食所伴發(fā)的IETM在大鼠MS中的作用。方法:48只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機(jī)分為對照組(NC)和模型組(HSHF),每組24只,NC組喂以正常膳食,HSHF組喂以高糖高脂膳食(0.25%cholic acid+1%cholesterol+10%sucrose+20%lard+70%normal fodder)。每組動物再隨機(jī)分為三組,NC:6月,9月,12月,每組8只;HSHF:6月,9月,12月,每組8只。各組動物分別于實驗第6月末、第9月末、第12月末進(jìn)行相應(yīng)的處理:在麻醉狀態(tài)下,腹主動脈取血并分離血漿;無菌條件下取腎周和附睪脂肪組織稱重;斷頭處死,迅速取腦,于冰上分離兩側(cè)海馬及皮層,一半置于10%的中性福爾馬林固定,常規(guī)制片備用;一半鋁箔紙包好液氮速凍,隨后放入-80℃冰箱備用。1.檢測血漿中MS相關(guān)指標(biāo)的變化采用酶法測定血漿甘油三酯(TG)、甘油二酯(DAG)、游離脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、總膽固醇(TCH)、血糖(FPG)及胰島素(FIN)水平。計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR),公式為:HOMA-IR=FPG×FIN/22.5。2.檢測血漿中炎癥相關(guān)因子的變化采用鱟試劑顯色法檢測血漿中內(nèi)毒素(LPS)水平;采用ELISA試劑盒檢測血漿中TNF-α、IL-6及IL-1的變化。結(jié)果:實驗期間,NC及HSHF組大鼠均狀況良好,各階段HSHF組大鼠較NC組大鼠體重及Lee’s指數(shù)明顯增加(P0.05),內(nèi)臟脂肪占體重百分比也明顯增加(P0.05),提示HSHF組大鼠出現(xiàn)肥胖。1.血漿中MS相關(guān)指標(biāo)的變化HSHF組大鼠各階段血漿中TG、TCH、DG、FFA、LDL、FPG、FIN水平均明顯升高(P0.05),HDL水平則顯著降低(P0.05)。提示經(jīng)過高糖高脂膳食喂養(yǎng)后,動物出現(xiàn)了糖代謝紊亂及異常脂蛋白血癥。2.血漿LPS及促炎因子的變化HSHF組大鼠血漿LPS在6月就有明顯的升高,且在整個實驗過程中,LPS一直處于高水平狀態(tài),與NC組相比差異具有顯著性(P0.001);TNF-α、IL-1及IL-6水平在不同階段較NC組也有不同程度的升高(P0.05)。結(jié)論:1.高糖高脂膳食可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常、異常脂血癥等,提示動物發(fā)生了MS。2.高糖高脂膳食誘導(dǎo)的IETM所致的慢性低度炎癥、脂質(zhì)異地蓄積與IR可能是MS發(fā)生的基礎(chǔ)。第二部分IETM在MS相關(guān)疾病AD發(fā)生發(fā)展中的作用研究目的:探討高糖高脂膳食誘發(fā)的IETM是否會導(dǎo)致大鼠AD樣改變及其在此過程中所起的作用。方法:動物分組與處理同實驗一。1.檢測腦組織中AD標(biāo)志性蛋白的水平采用Western blot方法檢測海馬Tau蛋白磷酸化水平;采用ELISA試劑盒檢測皮層及海馬Aβ含量。2.腦組織病理檢測皮層和海馬HE染色,觀察腦組織病理學(xué)變化。3.AD相關(guān)基因檢測采用PCR法檢測腦組織中AD相關(guān)基因BACE、APOE4、IDEm RNA的表達(dá)。4.腦組織炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測ELISA法檢測腦組織中DAG、FFA、TNF-α、IL-6、IL-1水平的變化;血漿LPS水平檢測;ELISA檢測血漿中MCP-1的變化;免疫組化法檢測腦組織CD68表達(dá);免疫熒光法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞OX-42的表達(dá)。采用IPP6.0軟件分析CD68及OX-42免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。5.腦組織胰島素抵抗水平檢測Western blot法檢測中樞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白JNK、PI-3K、AKT、GLUT、GSK-3β等水平。6.腦細(xì)胞凋亡水平檢測腦細(xì)胞凋亡采用TUNEL試劑盒,原位雜交二步法進(jìn)行檢測。采用IPP6.0軟件分析細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1.腦組織中AD標(biāo)志性蛋白的變化HSHF組大鼠海馬Tau蛋白199位點(diǎn)的過度磷酸化在6月就表達(dá)增加,一直持續(xù)到12月(P0.01);Tau蛋白396位點(diǎn)的磷酸化在6月時表達(dá)不是十分明顯,但9月、12月均異常升高(P0.01);Tau蛋白212位點(diǎn)的過度磷酸化隨著時間的推移表達(dá)逐漸增加,其較NC組相比,差異具有顯著性。HSHF組大鼠皮層及海馬Aβ含量在各個階段均明顯升高,其差異具有顯著性(P0.05)。2.腦組織病理學(xué)變化HSHF組大鼠腦組織皮層及海馬在6月均出現(xiàn)少量炎細(xì)胞的浸潤,小膠質(zhì)細(xì)胞及淋巴細(xì)胞增生,后逐漸加重,持續(xù)到12月炎性細(xì)胞浸潤最為明顯。3.A D相關(guān)基因變化HSHF組大鼠海馬組織IDE m RNA表達(dá)隨著時間的推移逐漸降低,到12月表達(dá)明顯減少;而APOE4、BACE基因m RNA表達(dá)均較NC組明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.腦組織炎癥相關(guān)指標(biāo)的變化HSHF組大鼠6月、9月、12月腦組織DAG、FFA、TNF-α、IL-6、IL-1均顯著升高(P0.001,P0.05);血漿中LPS、MCP-1等均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);腦組織免疫組化結(jié)果顯示,HSHF組大鼠在各個階段CD68表達(dá)均明顯增加;小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,隨著時間的推移活化程度逐漸加重。5.腦組織胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的改變HSHF組大鼠腦組織海馬p-JNK、p-PI-3K、p-AKT、GLUT蛋白含量在各個階段均較NC組明顯降低,且隨著時間的推移降低更加明顯。GSK-3β的含量則表現(xiàn)為隨著時間的推移逐漸升高。6.腦細(xì)胞凋亡凋亡結(jié)果顯示,隨著高糖高脂膳食喂養(yǎng)時間的延長,HSHF組大鼠腦組織中會出現(xiàn)大量的細(xì)胞凋亡,其較NC組相比,具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1.高糖高脂膳食所致模型組大鼠發(fā)生MS時始終伴有IETM,且其腦組織可表現(xiàn)出AD的特征性改變,成功構(gòu)建了MS相關(guān)AD的動物模型。2.IETM在引起外周慢性低度炎癥、脂質(zhì)異地蓄積及胰島素抵抗的同時也會導(dǎo)致腦組織出現(xiàn)同樣的改變。3.AD的發(fā)生與腦內(nèi)慢性炎癥、脂質(zhì)蓄積及胰島素抵抗有密切關(guān)系。第三部分IETM啟動MS相關(guān)疾病AD的基本機(jī)制目的:探討IETM啟動MS相關(guān)疾病AD的基本機(jī)制。方法:動物分組與處理同實驗一。1.血漿中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的檢測ELISA法檢測血漿中丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)的含量。2.免疫熒光法檢測腦組織活性氧水平取出液氮凍存的腦組織OCT包埋制備成冰凍塊,用冰凍切片機(jī)以5um厚度連續(xù)切片,將DHE工作液滴加于冰凍切片上,熒光顯微鏡下觀察腦組織ROS水平。3.Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)取凍存的腦組織Western blot法檢測GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)。4.ELISA測定腦組織勻漿FFA、DAG的含量。結(jié)果:1.HSHF組大鼠血漿MDA水平與NC組相比顯著升高,且腦組織中ROS含量明顯增加,隨著時間的推移,ROS增加更為明顯。2.Western blot檢測GRP78與CHOP,GRP78結(jié)果顯示HSHF組在6月,9月逐漸升高,9月達(dá)到最大值,12月有所下降但仍高于NC組;CHOP在NC組幾乎不表達(dá),HSHF組隨著時間的推移表達(dá)逐漸增加,到12月達(dá)到最大值。3.HSHF組動物腦組織勻漿FFA、DAG含量明顯增高,提示腦組織出現(xiàn)脂質(zhì)異地蓄積,進(jìn)而導(dǎo)致脂毒激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。結(jié)論:1.IETM所致的氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是所有代謝性疾病發(fā)生的基本機(jī)制。2.AD的發(fā)生機(jī)制與MS發(fā)生機(jī)制基本一致,可以初步認(rèn)為AD也屬于MS相關(guān)疾病。綜上所述,本研究得出以下結(jié)論:1.高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠可伴隨IETM的發(fā)生,且程度逐漸加重;IETM可導(dǎo)致MS相關(guān)疾病的發(fā)生。2.IETM所致慢性低度炎癥、脂質(zhì)異地蓄積、IR是MS與AD發(fā)病的共同機(jī)制,可以初步認(rèn)為AD也屬于MS相關(guān)疾病。3.IETM所致的氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是所有代謝性疾病的基本機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：高糖高脂 代謝綜合征 炎癥 腸源性內(nèi)毒素血癥 胰島素抵抗 代謝綜合征 腸源性內(nèi)毒素血癥 阿爾茨海默病 胰島素抵抗 炎癥 代謝綜合征 腸源性內(nèi)毒素血癥 阿爾茨海默病 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要6-13
• 英文摘要13-21
• 常用縮寫詞中英文對照表21-23
• 前言23-27
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第一部分 高糖高脂膳食誘發(fā)的IETM在大鼠MS中的作用27-46
• 實驗一IETM在高糖高脂膳食所誘發(fā)MS中的作用27-46
• 1 材料與方法27-31
• 2 結(jié)果31-38
• 3 討論38-43
• 4 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 第二部分 IETM在高糖高脂誘發(fā)MS相關(guān)疾病AD中的作用46-95
• 實驗二 高糖高脂膳食誘發(fā)MS相關(guān)疾病AD的特征性改變46-62
• 1 材料與方法46-50
• 2 結(jié)果50-55
• 3 討論55-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 實驗三 腦組織炎癥狀態(tài)與脂質(zhì)蓄積的檢測62-69
• 1 材料與方法62-64
• 2 結(jié)果64-69
• 實驗四 腦組織IR狀態(tài)檢測69-75
• 1 材料與方法69-71
• 2 結(jié)果71-75
• 實驗五 腦細(xì)胞凋亡檢測75-95
• 1 材料與方法75-76
• 2 結(jié)果76-77
• 3 討論77-88
• 4 結(jié)論88-89
• 參考文獻(xiàn)89-95
• 第三部分 IETM啟動MS相關(guān)AD的基本機(jī)制95-114
• 實驗六 腦組織氧化應(yīng)激狀態(tài)95-98
• 1 材料與方法95-96
• 2 結(jié)果96-98
• 實驗七 腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)98-109
• 1 材料與方法98-99
• 2 結(jié)果99-100
• 3 討論100-107
• 4 結(jié)論107-109
• 參考文獻(xiàn)109-114
• 綜述114-137
• 參考文獻(xiàn)126-137
• 致謝137-138
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果138-139
• 個人簡介139

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本文編號：833021