本文關鍵詞：低分子量硫酸軟骨素對Aβ引起神經毒性的防治作用及機制研究

  更多相關文章： 低分子量硫酸軟骨素(LMWCS) 淀粉樣蛋白β(Aβ) 神經保護 阿爾茨海默病(AD)

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又被稱為老年癡呆,是一類常見的神經退行性疾病,它的臨床特點是患者表現(xiàn)出學習記憶障礙或認知功能減退,病理特征是出現(xiàn)淀粉樣蛋白p(Aβ)沉積產生的老年斑(SP)、神經纖維纏結(NFTs),以及神經細胞大量丟失或死亡。Ap在體外和體內實驗中均表現(xiàn)出較明顯的神經毒性,從而在AD的發(fā)病機制中起到了重要作用。因此,Ap可以作為神經細胞毒性的誘導分子,它在AD的治療與藥物的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了巨大的作用。本課題的研究對象為低分子量硫酸軟骨素(LMWCS),它是由來源于鯊魚軟骨中的硫酸軟骨素C經過氧化降解,并用相對分子質量(Mr)截留值為2000 Da和5000 Da的超濾膜截留后得到的物質,將Mr2000 Da、2000-5000 Da、5000 Da的3個組分命名為LMWCS-A、B、C,氧化降解后的總組分命名為LMWCS-D,這4個組分的平均Mr分別為1173、3928、6146、5846。本研究是以Ap作為研究靶點,在體外觀察了LMWCS 對 AP25-35損傷大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞以及神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的保護作用,并在細胞水平上探討了LMWCS抗Aβ25-35申經毒性損傷的相關作用機制,還觀察了LMWCS對側腦室注射Aβ1-40所致AD小鼠模型學習記憶功能的影響及對其機制進行了初步的研究。1 LMWCS對Aβ25-35 引起神經細胞損傷的保護作用及其機制的研究本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)的方法觀察了不同Mr的LMWCS對AP25-35誘導PC12及SH-SY5Y細胞損傷的影響,結果發(fā)現(xiàn)Aβ25-35可以明顯降低神經細胞的MTT還原能力,減少存活細胞的數(shù)量；而加入50、100和200μg/mL LMWCS預孵育后,Aβ25-35所引起神經細胞損傷受到了抑制,神經細胞的存活率增加,其中加入LMWCS-B的神經細胞存活率最高,并且隨著LMWCS濃度增加,對神經細胞的改善作用增強,提示不同Mr的LMWCS均可明顯抑制Aβ25-35所引起的神經細胞毒性,并且LMWCS-B(平均Mr為3928)對神經細胞的保護作用最明顯。因此,后期實驗均采用此LMWCS組分來進行。本研究還觀察了經過LMWCS預孵育再加入Aβ25-35進行損傷、Aβ25-35與LMWCS共孵育以及Aβ25-35先進行損傷再加LMWCS保護3種處理方式的神經細胞的存活情況,從而確定LMWCS抗Aβ25-35神經毒性損傷的作用環(huán)節(jié)。結果發(fā)現(xiàn),在這3種處理方式中Aβ25-35對神經細胞均有損傷,LMWCS給藥組的細胞存活率高于模型組,并且LMWCS預孵育方式的細胞存活率高于其他方式,表明LMWCS能夠多環(huán)節(jié)的抑制Aβ25-35的神經毒性。LMWCS能夠抑制Aβ25-35誘導PC12和(?)SH-SY5Y細胞產生的神經毒性,但其抑制作用的相關機制不明確。因此,本研究在細胞水平上探討了LMWCS保護Aβ25-35誘導神經毒性損傷的作用機制。結果發(fā)現(xiàn),30μmol/L Aβ25-35可以明顯誘導PC12和SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡,而加入50、100和200μg/ml的LMWCS預孵育后,PC12和SH-SY5Y細胞的凋亡均明顯受到抑制,凋亡率隨著濃度的增加而呈現(xiàn)劑量依賴性降低。深入研究LMWC S抗Aβ25-35所致神經細胞凋亡的作用機制發(fā)現(xiàn),LMWCS能夠明顯抑制Aβ25-35誘導產生的神經細胞內游離Ca2+濃度升高、自由基的形成以及細胞內脂質過氧化產物含量的增加,還能夠降低線粒體膜電位(MMP)以及抑制凋亡促進蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表達的升高,并且可以激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,表明LMWCS抑制Aβ25-35誘導產生的神經細胞毒性損傷主要是通過抑制自由基的產生、提高自由基的清除速率、抑制線粒體障礙以及抑制細胞內游離Ca2+濃度的升高而增加了凋亡抑制相關蛋白的表達、阻斷了下游凋亡促進蛋白的表達,從而最終抑制Aβ25-35誘導產生的PC12和SH-SY5Y細胞的凋亡。2 LMWCS對側腦室注射Aβ1-40所致AD動物學習記憶功能的影響及機制的研究本研究利用側腦室注射Aβ1-40所致老年癡呆癥小鼠為模型,采用曠場實驗(OFT)和Morris水迷宮(MWM)的方法觀察LMWCS對AD小鼠學習記憶功能的改善作用,并在細胞及分子水平研究了LMWCS對AD小鼠作用的可能分子機制。結果表明,側腦室注射Aβ1-40能夠明顯損傷小鼠的學習記憶功能,給予LMWCS后,在OFT測試中,Ⅰ.MWCS增加了AD小鼠在盒內的穿越格數(shù)、站立次數(shù)以及小鼠進行自我修飾的次數(shù)；在MWM測試的過程中,LMWCS可以縮短小鼠潛伏期和游泳路程,在空間探索實驗中可以減少AD小鼠第一次到達原平臺的時間、增加小鼠穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)、增加小鼠在目標象限的時間和路程,從而說明LMWCS可以明顯改善側腦室注射Ap1-40所致AD小鼠的學習記憶功能。學習記憶測試結束后,小鼠經斷頭處死,剝離大腦海馬和皮層區(qū),采用比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、Na+/K+-ATP酶活力及丙二醛(MDA)含量,測定膽堿乙�；D移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AC hE)活性。結果表明,LMWCS可以明顯提高Aβ1-40所致AD小鼠海馬和皮層區(qū)中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,以及Na+/K+-ATP酶、Ch AT的活性,降低了MDA的含量和AChE的活性,提示LMWCS可以改變Aβ1-40所致AD小鼠腦內氧化應激水平,維持小鼠腦內能量代謝的穩(wěn)定性,改善了小鼠大腦中海馬和皮層區(qū)的膽堿能系統(tǒng)功能。小鼠大腦切片進行HE染色后發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)組織形態(tài)學改變,Aβ1-40可導致腦組織海馬CA1區(qū)神經元出現(xiàn)損傷,而給予LMWCS后神經元的損傷情況改善。免疫組化結果顯示,Aβ1-40能夠增加小鼠大腦海馬CA1區(qū)Caspase-9、弓的活性。而L MWCS可以降低Caspase-9、-3的表達,使其陽性細胞數(shù)量減少,起到抗凋亡的作用。Western blot結果顯示,LMWCS在凋亡過程中表現(xiàn)出了抗凋亡作用,可激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,抑制在小鼠細胞凋亡中起關鍵作用的Bax、Caspase-9、-3蛋白表達,最終起到了降低了細胞凋亡的作用。LMWCS的作用機制可能與降低Aβ神經毒性作用,抑制神經元的凋亡等有關,可能在治療AD的作用中具有一定的作用。綜上所述,本研究第一次在體外和體內實驗中評價LMWCS對Ap誘導產生的細胞凋亡具有保護作用。LMWCS具有對Ap所致AD模型的保護作用,可有效抑制Aβ25-35誘導產生的PC12細胞和SH-SY5Y細胞的毒性作用,拮抗細胞內游離Ca2+濃度的升高、自由基的產生和聚集、線粒體的功能障礙,還可以降低凋亡促進蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表達的升高,激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達,最終抑制Aβ25-35所引起的神經細胞凋亡。與此同時,LMWCS在體內實驗中表現(xiàn)出明顯改善Aβ1-40所致模型小鼠學習記憶障礙的作用,并能提高模型小鼠大腦內海馬和皮層區(qū)SOD、GSH-Px的活力水平,清除過氧化產物,降低MDA的含量,從而改善小鼠大腦內氧化和抗氧化的紊亂狀態(tài),保護能量代謝關鍵酶Na+/K+-ATP酶免受氧化損傷,進而維持腦內能量代謝的穩(wěn)定,還能通過促進中樞膽堿能系統(tǒng)乙酰膽堿(ACh)的合成而改善膽堿能系統(tǒng)功能,起到保護小鼠大腦的作用。因此,LMWCS可以用于預防或治療Ap誘導產生的神經毒性,能夠作為一種抗AD的候選活性成分,用于制備治療、改善或預防認知功能衰退相關的神經系統(tǒng)疾病的藥物。
【關鍵詞】：低分子量硫酸軟骨素(LMWCS) 淀粉樣蛋白β(Aβ) 神經保護 阿爾茨海默病(AD)
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要11-15
• Abstract15-19
• 縮略語說明19-22
• 第一章 前言22-41
• 1 AD研究現(xiàn)狀22-24
• 2 AD發(fā)病機制的研究24-29
• 3 AD模型的制備29-32
• 4 AD的治療32-35
• 5 糖類及其衍生物抗AD研究概況35-39
• 6 本課題擬解決的問題和意義39-41
• 第二章 LMWCS對Aβ誘導的神經細胞損傷的保護作用及機制探討41-71
• 1 實驗材料41-45
• 1.1 藥品及試劑41-42
• 1.2 儀器及耗材42-44
• 1.3 工作溶液的配制44-45
• 1.4 細胞45
• 2 實驗方法45-52
• 2.1 LMWCS的制備及分析45-46
• 2.2 細胞活力測定46-47
• 2.3 細胞凋亡測定47
• 2.4 游離鈣離子濃度測定47
• 2.5 ROS測定47-48
• 2.6 細胞內氧化應激及能量代謝水平測定48-49
• 2.7 MMP測定49
• 2.8 Caspase-3酶測定49-50
• 2.9 總蛋白的提取及定量50-51
• 2.10 Western blot分析51
• 2.11 統(tǒng)計學處理51-52
• 3 實驗結果52-67
• 3.1 LMWCS的制備52-54
• 3.2 LMWCS對Aβ25-35誘導的神經細胞損傷的保護作用54-57
• 3.3 LMWCS對Aβ25-35引起細胞凋亡的影響57
• 3.4 LMWCS對Aβ25-35引起細胞內游離鈣離子濃度變化的影響57-59
• 3.5 LMWCS對Aβ25-35引起細胞內ROS變化的影響59-60
• 3.6 LMWCS對Aβ25-35引起細胞內氧化應激水平變化的影響60-63
• 3.7 LMWCS對Aβ25-35引起的MMP變化的影響63
• 3.8 LMWCS對Aβ25-35誘導細胞表達Caspase-3變化的影響63-65
• 3.9 LMWCS對Aβ25-35誘導細胞凋亡相關蛋白表達量變化的影響65-67
• 4 討論67-70
• 5 小結70-71
• 第三章 LMWCS對Aβ誘導小鼠腦損傷的保護作用及機制的研究71-97
• 1 實驗材料71-72
• 1.1 藥品及試劑71
• 1.2 儀器71
• 1.3 工作溶液的配制71-72
• 1.4 動物來源72
• 2 實驗方法72-79
• 2.1 動物分組和給藥方法72-73
• 2.2 模型制作73
• 2.3 行為學檢測73-74
• 2.4 小鼠大腦海馬和皮層區(qū)氧化應激及能量代謝水平的測定74
• 2.5 小鼠大腦海馬和皮層區(qū)膽堿能功能測定74-75
• 2.6 免疫組織化學75-78
• 2.7 總蛋白的提取及定量78
• 2.8 Western blot分析78
• 2.9 實驗結果統(tǒng)計78-79
• 3 實驗結果79-91
• 3.1 LMWCS對Aβ模型小鼠學習記憶能力變化的影響79-82
• 3.2 LMWCS對Aβ模型小鼠腦組織氧化應激水平變化的影響82-86
• 3.3 LMWCS對Aβ模型小鼠大腦中膽堿酯酶活性變化的影響86-87
• 3.4 免疫組化結果87-90
• 3.5 Western blot結果90-91
• 4 討論91-96
• 5 小結96-97
• 總結與展望97-99
• 1 論文主要結論97-98
• 2 論文創(chuàng)新點98
• 3 論文的不足之處98
• 4 展望98-99
• 參考文獻99-114
• 致謝114-115
• 博士期間發(fā)表的論文115-116
• 論文116-130
• 附件130

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陳惠黎;;糖生物學是研究生命現(xiàn)象的第三個里程碑——糖生物學�？蜓訹J];生命科學;2011年06期

2 胡金鳳,耿美玉;老年斑、神經元纖維纏結與硫酸多糖[J];中國藥理學通報;2003年01期

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本文編號：829386