本文關(guān)鍵詞：miRNA-200c-3p調(diào)控阿爾茨海默病的分子機(jī)制研究

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【摘要】：miR-200c-3p屬miR-200家族成員之一,研究證據(jù)顯示在亨廷頓病和腦缺血小鼠模型腦組織中其表達(dá)上調(diào),這提示miR-200c-3p在CNS的發(fā)育分化和衰老退化進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要的作用。CREB是真核生物中一種關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子,它能增強(qiáng)突觸聯(lián)系,影響神經(jīng)元的可塑性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的合成,與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示,CREB1 mRNA3'-UTR序列上存在著miR-200c-3p的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn),但miR-200c-3p調(diào)控CREB1表達(dá)的具體機(jī)制以及它對(duì)阿爾茨海默病的調(diào)控作用目前尚不清楚。目的：通過比較阿爾茨海默病模型小鼠和對(duì)照組小鼠海馬組織中miR-200c-3p和CREB1表達(dá)差異,找出兩者表達(dá)變化與阿爾茨海默病的相關(guān)性,探究miR-200c-3p對(duì)關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子CREB1表達(dá)的調(diào)控,揭示miR-200c-3p調(diào)節(jié)阿爾茨海默病的分子機(jī)制。方法：清潔級(jí)健康雄性昆明種小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組。阿爾茨海默病模型組每日腹腔注射D-半乳糖90 mg/kg(生理鹽水配制)和AICl340 mg/kg(生理鹽水配制)溶液,連續(xù)90 d；對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。在造模過程中觀察小鼠的一般情況,每周對(duì)小鼠進(jìn)行一次稱重并記錄體重變化情況。采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)阿爾茨海默病模型小鼠與對(duì)照組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠海馬組織中miR-200c-3p的表達(dá)。Western-blot檢測(cè)海馬組織中關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子CREB1蛋白的表達(dá)水平。構(gòu)建含CREB1 mRNA3'-UTR蟲熒光素酶基因報(bào)告載體pGL3C-CREB1 UTR和pGL3C-CREB1 UTR mutant,分別與miR-200c-3p mimic或其陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,使用promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性,分析miR-200c-3p對(duì)CREB1表達(dá)的調(diào)控。miR-200c-3p mimic或miR-200c-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染Neuro2a細(xì)胞,以增加或減少細(xì)胞內(nèi)miR-200c-3p的內(nèi)源性表達(dá),24h后收樣,通過Western Bolt檢測(cè)CREB1蛋白表達(dá)量,驗(yàn)證miR-200c-3p對(duì)CREB1表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果：(1)小鼠腹腔注射D-gal和AICl3后第6周至造模結(jié)束模型組小鼠體重明顯低于對(duì)照組小鼠,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,阿爾茨海默病模型組小鼠探索新物體所用的時(shí)間少于對(duì)照組(P0.01)；阿爾茨海默病小鼠的分辨指數(shù)明顯低于對(duì)照組小鼠(P0.001),表明D-gal聯(lián)合AICl3誘導(dǎo)的阿爾茨海默病模型小鼠其物體識(shí)別記憶能力降低。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,阿爾茨海默病模型小鼠海馬組織中miR-200c-3p表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 (4) Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,阿爾茨海默病小鼠海馬組織中CREB1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P0.01)。(5)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,pGL3C-CREB1 3'UTR和miR-200c-3p mimic共轉(zhuǎn)染時(shí),蟲熒光素酶的活性明顯被抑制(P0.05)；而將PGL3C-CREB1 3'UTR中miR-200c-3p的結(jié)合位點(diǎn)突變,變成新的載體PGL3C-CREB1 3'UTR mutant,與miR-200c-3p共轉(zhuǎn)染時(shí),蟲熒光素酶的活性未見明顯變化。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果說明miR-200c-3p能夠與CREB1 mRNA3'UTR結(jié)合抑制CREB1的表達(dá)。(6)Western Bolt結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-200c-3p mimic的Neuro2a細(xì)胞,其CREB1蛋白的表達(dá)受到明顯抑制(P0.01),而轉(zhuǎn)染miR-200c-3p inhibitor的細(xì)胞,CREB1蛋白的表達(dá)量明顯增加(P0.01)。結(jié)論：本研究表明,D-gal聯(lián)合AlCl3誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠海馬組織中,miR-200c-3p的表達(dá)增強(qiáng),關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子CREB1的表達(dá)受到抑制；miR-200c-3p是通過與CREB1 mRNA 3'UTR序列結(jié)合,抑制CREB1蛋白的表達(dá),參與對(duì)阿爾茨海默病的調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：miR-200c-3p CREB 海馬 阿爾茨海默病
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-10
• 第1章 緒論10-12
• 第2章 研究報(bào)告12-36
• 2.1 前言12
• 2.2 材料12-17
• 2.3 方法17-26
• 2.4 結(jié)果26-32
• 2.5 討論32-35
• 2.6 結(jié)論35-36
• 致謝36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 附：技術(shù)路線圖41-42
• 綜述一 MicroRNA在阿爾茨海默病中的研究進(jìn)展42-48
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 綜述二 CREB在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究進(jìn)展48-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 個(gè)人簡(jiǎn)介55-56

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