本文關鍵詞：長鏈非編碼RNA在嗎啡成癮及心肌缺血再灌注損傷中作用的初步探究

  更多相關文章： 嗎啡 成癮 免疫抑制 長鏈非編碼RNA 腦前額葉皮層 神經小膠質細胞 心肌缺血再灌注損傷 缺氧再復氧損傷 長鏈非編碼RNA 細胞凋亡 細胞自噬 造血干細胞 約束應激 免疫抑制 壞死 凋亡

【摘要】：研究背景和研究意義嗎啡是阿片中主要的生物堿,有強烈的麻醉、鎮(zhèn)痛作用,是目前治療疼痛最有效的化合物之一,其用于疼痛治療已有數百年的歷史,然而它的使用有很多限制,如：產生依賴性、耐受性、痛覺過敏、精神朦朧及免疫調節(jié),而且毒品濫用也是威脅人類生存的重大社會問題。因此對其分子機制的研究有助于找到有效的預防和治療方法。藥物成癮有著極其復雜的機制,國內外數十年來對其機制的研究多從行為學、受體、神經遞質、蛋白差異表達等方面進行研究。但是從ncRNA方面,尤其是長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)參與調控嗎啡成癮的研究卻鮮見報道。我們從一個新穎的角度來研究嗎啡依賴性等副作用的分子機制,即lncRNA是如何參與調控嗎啡副作用的。lncRNA是一類長度大于200nt的RNA,本身不編碼蛋白質,而是以RNA的形式在多個層面上(表觀遺傳、轉錄、轉錄后水平)調控基因的表達。近年來的研究表明：lncRNA廣泛參與各種生物學過程,其異常表達與多種疾病密切相關。lncRNA逐漸成為疾病治療所靶向的新分子。我們所用的動物模型是嗎啡成癮的C57 BL/6小鼠,選用的實驗材料是大腦腦前額葉皮層(Prefrontal cortex, PFC),因為前額葉皮層作為大腦的高級中樞,是腦中對嗎啡最敏感的部位之一,在藥物成癮過程中發(fā)揮重要作用。神經解剖學顯示PFC存在密集的μ阿片受體。PFC能夠調控成癮相關的行為和認知變化。神經小膠質細胞(Microglia, MG)是中樞神經系統(tǒng)中最小的一種膠質細胞,是機體神經系統(tǒng)的免疫細胞,可保護大腦免于損傷及大腦疾病再生。MG在神經元的生理活動中起著營養(yǎng)、支持、保護等重要功能,是CNS中的第一道也是最主要的一道免疫防線。MG常被用作研究嗎啡成癮的重要的體外模型。我們在建立了嗎啡成癮小鼠模型后,提取了小鼠腦前額葉皮層總RNA,質檢成功后進行l(wèi)ncRNA表達譜芯片的檢測,并對其進行qRT-PCR驗證。與此同時,我們用嗎啡處理MG后進行細胞水平的驗證。本研究的意義是：從lncRNA的角度來研究嗎啡副作用,為研究阿片類物質依賴性、成癮性及免疫抑制機制提供了新的思路,擴展和豐富了成癮相關的分子調控網絡； 為預防與治療成癮性疾病提供理論依據和新的治療靶標；為lncRNA作為臨床戒毒藥物靶點提供新的應用前景。研究結果1. lncRNA表達譜芯片檢測篩選出腦前額葉皮層中493個上調的lncRNA和255個下調的lncRNA為了找出參與嗎啡副作用形成的lncRNA,我們建立了嗎啡成癮的小鼠模型,解剖成癮小鼠,冰上快速分離出PFC,提取組織RNA后送到芯片公司進行l(wèi)ncRNA表達譜芯片的檢測,其中上調的和下調的lncRNA數目分別是493個和255(變化倍數≥1.5,P ≤ 0.05)。2. qRT-PCR結果顯示5種lncRNA在腦前額葉皮層中差異表達我們進一步從芯片結果中挑選出10個變化倍數最大(6),P值最小(0.01)的lncRNA進行qRT-PCR驗證。在腦組織中驗證出5個lncRNA與芯片結果相符(AK157323、AK007908、AK160450、AK018061和AK140599),其中顯著上調的為AK157323和AK140599,顯著下調的為AK007908、AK160450和AK018061,可進行下一步研究。結論我們通過提取總RNA,并對lncRNA表達譜進行芯片分析,結合qRT-PCR驗證,最終確定AK157323、AK007908、AK160450、AK018061及AK140599在嗎啡成癮小鼠的PFC區(qū),具有顯著的變化趨勢,很有可能參與嗎啡引起的依賴性、免疫抑制或細胞凋亡等過程,將為進一步的分子機制研究奠定堅實的基礎。研究背景和研究意義心臟疾病是威脅人類健康的頭號殺手。對于治療心肌梗死(myocardial infarction, MI),冠脈再灌注這—治療方法能抑制心力衰竭的發(fā)生并降低死亡率。雖然這一方法十分有效,但是這個過程本身也會引起心肌損傷和病理性心肌重構,這種損傷被稱為“心肌缺血再灌注(Ischemia and Reperfusion, I/R)損傷”。其中,最顯著的表現就是不可逆的細胞死亡。研究者們進行體外研究時,通常采用的體外模型是對心肌細胞進行缺氧再復氧(Hypoxia/Reoxygenation, H/R)處理,以模擬體內I/R的過程,即先進行去血清低葡萄糖并缺氧處理,再進行恢復血清和葡萄糖并復氧處理。H/R誘導的損傷性的細胞凋亡和破壞性的細胞自噬,是心肌梗死所引起組織損傷的重要病理因素。因此,探究H/R損傷的分子機制或許能為治療心肌缺血再灌注損傷提供潛在的靶標。心臟基因調控網絡的異常調節(jié)與心臟疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系,而許多研究表明lncRNA在包括心血管疾病在內的眾多人類疾病中起作用。我們建立了心肌缺血再灌注損傷的體外研究模型,提取細胞總RNA后進行l(wèi)ncRNA高通量測序,并進行了相關生物信息學的分析。本研究從lncRNA的角度探究心肌缺血再灌注損傷的分子機制,為缺血性心臟疾病的治療提供新的理論基礎和分子靶標。研究結果1.缺氧再復氧誘導H9c2心肌細胞發(fā)生凋亡對H9c2心肌細胞進行H/R處理之后,從細胞形態(tài)上看,部分細胞變圓漂浮起來已經死亡。從Western Blot的結果看,H/R能夠顯著誘導心肌細胞凋亡。流式細胞術的結果又進一步驗證了這個結論,同時,細胞壞死也是增加的。2.缺氧再復氧誘導H9c2心肌細胞發(fā)生自噬Western Blot結果顯示,細胞進行H/R處理之后,細胞的自噬水平顯著增加。3.高通量測序結果高通量測序檢測出46個表達差異顯著的mRNA轉錄本、2個表達差異顯著的已知lncRNA轉錄本、1029個表達差異顯著的新lncRNA轉錄本及100個表達差異顯著的基因。結論缺氧再復氧能夠顯著誘導心肌細胞凋亡和自噬。說明我們的體外模型建立得比較成功和順利。在后續(xù)的研究中,我們將基于高通量測序的檢測結果結合lncRNA靶基因預測、IncRNA-miRNA互作、KEGG生物通路富集分析、GO基因功能富集分析等生物信息學分析,進行分子機制的深入研究。研究背景和研究目的干細胞是具有自我更新能力和分化潛能的一類細胞,能夠增殖并產生高度分化的功能細胞。近年來興起了干細胞移植治療這一先進的醫(yī)學技術。造血干細胞(Hematopoietic Stem Cells, HSCs)是成體中研究最為廣泛的的干細胞之一,并且是已被證明具有臨床應用價值的干細胞類型。HSC為多潛能成體干細胞,能分化為所有成熟的血細胞。應激會導致機體損傷,其中慢性應激會對免疫系統(tǒng)產生較大影響,引起癌癥、免疫失調等眾多疾病。約束應激能夠上調糖皮質激素的水平,誘導脾臟、胸腺及外周血中淋巴細胞凋亡。已有報道表明,骨髓間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)能夠抑制約束應激引起的脾淋巴細胞的凋亡。而HSC是所有造血細胞和免疫細胞的起源,相對于MSC而言在功能上專一性更強。本研究的目的在于探究HSC是否也對約束應激所引起的免疫抑制起作用,甚至有更強的作用。我們的體內實驗是通過建立約束應激的Balb/C小鼠模型進行探究的。相應的體外研究是用人工合成的糖皮質類固醇激素地塞米松處理脾淋巴細胞建立體外模型。我們從供體小鼠骨髓中用磁珠分選法提取HSC,用CFDASE處理進行綠色熒光標記后,尾靜脈注射到受體小鼠的體內。對受體小鼠建立約束應激模型,解剖小鼠,檢測綠色熒光細胞在受體小鼠的脾臟和骨髓中的分布情況。體外實驗則是將提取的HSC與正常脾臟細胞共培養(yǎng),并用地塞米松處理細胞,流式細胞術檢測細胞的凋亡和壞死情況。實驗結果1.約束應激3天起,脾臟和骨髓中出現綠色熒光標記的HSC細胞注射有綠色熒光標記的HSC的受體小鼠約束應激2天后,脾臟和骨髓中尚未出現HSC；3天后脾臟和骨髓中已出現HSC；4天后脾臟和骨髓中HSC更多。2.在體外HSC抑制脾臟細胞的壞死而非凋亡體外實驗顯示,糖皮質激素地塞米松誘導脾臟細胞壞死和凋亡。而加入HSC共培養(yǎng)后,脾臟細胞的壞死率降低,凋亡率升高。結論1.約束應激第三天,綠色熒光標記的HSC出現于受體小鼠脾臟和骨髓中,推測HSC可能在損傷部位起修復作用。2.HSC抑制地塞米松誘導的脾臟細胞壞死而促進地塞米松誘導的細胞凋亡。
【關鍵詞】：嗎啡 成癮 免疫抑制 長鏈非編碼RNA 腦前額葉皮層 神經小膠質細胞 心肌缺血再灌注損傷 缺氧再復氧損傷 長鏈非編碼RNA 細胞凋亡 細胞自噬 造血干細胞 約束應激 免疫抑制 壞死 凋亡
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.6
【目錄】：

• 第一部分 長鏈非編碼RNA參與嗎啡成癮的初步探究7-45
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 縮略詞表12-13
• 前言13-23
• 1. 嗎啡13-15
• 1.1 阿片類藥物13
• 1.2 嗎啡及其副作用13-15
• 2. lncRNA15-21
• 2.1 lncRNA的特點15-16
• 2.2 lncRNA的分類16
• 2.3 lncRNA的宏觀作用機制16-18
• 2.4 lncRNA的生物學功能18
• 2.5 lncRNA與生理病理18
• 2.6 lncRNA與藥物成癮18-20
• 2.7 lncRNA的研究技術和主要工具20-21
• 3. 腦前額葉皮層和神經小膠質細胞21-23
• 實驗材料與方法23-35
• 1. 實驗材料23
• 2. 試劑和耗材23-24
• 3. 儀器設備24
• 4. 主要溶液及試劑配方24-26
• 4.1 BV2細胞培養(yǎng)用試劑24-25
• 4.2 核酸電泳用試劑25-26
• 4.3 DEPC水的配制26
• 5. 實驗方法26-35
• 5.1 小鼠的飼養(yǎng)與管理26
• 5.2 嗎啡成癮模型的建立26-27
• 5.3 小鼠的腦部解剖及腦前額葉皮層的提取27-28
• 5.4 RNA的提取28-29
• 5.5 PCR實驗29-30
• 5.6 細胞培養(yǎng)30-32
• 5.7 lncRNA芯片32
• 5.8 統(tǒng)計學分析32-35
• 實驗結果35-37
• 1. 嗎啡依賴的小鼠體重減輕35
• 2. 提取的嗎啡成癮小鼠腦前額葉皮層總RNA的質量符合后續(xù)實驗要求35
• 3. lncRNA芯片檢測結果35
• 4. 利用qRT-PCR法對腦前額葉皮層進行芯片結果的驗證35
• 5. 嗎啡處理BV2細胞后提取的總RNA質量符合后續(xù)實驗要求35-36
• 6. BV2細胞系中qRT-PCR法對芯片結果的驗證36-37
• 討論37-39
• 附圖39-45
• 第二部分 長鏈非編碼RNA參與心肌缺血再灌注損傷的體外研究45-77
• 中文摘要45-47
• ABSTRACT47-49
• 縮略詞表49-51
• 前言51-53
• 實驗材料與方法53-63
• 1. 實驗材料53
• 2. 試劑和耗材53
• 3. 儀器設備53-54
• 4. 主要溶液及試劑配方54-57
• 4.1 H9c2細胞培養(yǎng)用試劑54
• 4.2 SDS-PAGE用試劑54-55
• 4.3 轉膜用試劑55-57
• 5. 實驗方法57-63
• 5.1 心肌缺血再灌注體外模型的建立57
• 5.2 Western Blot實驗57-60
• 5.3 lncRNA高通量測序60-63
• 實驗結果63-65
• 1. 缺氧再復氧后,細胞死亡增加63
• 2. 缺氧再復氧誘導細胞凋亡63
• 3. 缺氧再復氧明顯誘導細胞自噬63
• 4. 在缺氧處理8h時β-arrestin2和TLR-9蛋白表達水平較其它時間點變化大63
• 5. 高通量測序檢測出46個表達差異顯著的mRNA轉錄本63
• 6. 高通量測序檢測出2個表達差異顯著的已知lncRNA轉錄本63
• 7. 高通量測序檢測出1029個表達差異顯著的新lncRNA轉錄本63-64
• 8. 高通量測序檢測出100個表達差異顯著的基因及差異基因的KEGG生物通路富集分析和GO基因功能富集分析結果64-65
• 討論65-67
• 附圖67-77
• 第三部分 骨髓造血干細胞在約束應激引起的免疫抑制中的作用77-101
• 中文摘要77-79
• ABSTRACT79-81
• 縮略詞表81-83
• 前言83-85
• 實驗材料與方法85-93
• 1. 實驗材料85
• 2. 試劑和耗材85
• 3. 儀器設備85
• 4. 主要溶液及試劑配方85-86
• 4.1 造血干細胞和脾臟細胞提取過程中所需試劑85-86
• 4.2 脾臟細胞培養(yǎng)用試劑86
• 4.3 地塞米松儲存液86
• 4.4 PI單染實驗用試劑86
• 5. 實驗方法86-93
• 5.1 CD34+造血干細胞的提取87-88
• 5.2 小鼠脾臟細胞的提取88
• 5.3 CD34+造血干細胞的體內示蹤實驗88-89
• 5.4 小鼠慢性約束應激模型的建立89
• 5.5 脾臟細胞在體外與CD34+造血干細胞共培養(yǎng)89
• 5.6 流式細胞術實驗89-93
• 實驗結果93-95
• 1. 約束應激3天,脾臟和骨髓中出現HSC細胞93
• 2. 在體外HSC抑制脾臟細胞的壞死而非凋亡93-95
• 討論95-97
• 附圖97-101
• 參考文獻101-107
• 致謝107-109
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文109-110
• 學位論文評閱及答辯情況表110

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 王靚;趙殊;杜明蘭;;幾種常用中藥對心肌缺血—再灌注損傷的防治研究[J];中國衛(wèi)生產業(yè);2014年01期

2 王曙光,徐小虎,高慶春,黃如訓;急性心肌缺血再灌注對腦組織的影響[J];中國神經精神疾病雜志;2001年03期

3 劉雅,董振明;白細胞與心肌缺血再灌注損傷[J];河北醫(yī)藥;2001年12期

4 林函;心肌缺血再灌注損傷中線粒體的作用[J];國外醫(yī)學.麻醉學與復蘇分冊;2002年05期

5 張英杰;血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑在心肌缺血再灌注損傷中的作用[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志;2002年02期

6 高國棟,韓志巖;核因子-κB與心肌缺血再灌注損傷[J];中國分子心臟病學雜志;2002年06期

7 楊陽;中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷研究新進展[J];現代中西醫(yī)結合雜志;2003年11期

8 楊彥玲,師養(yǎng)榮,李建龍,陳雅慧;心肌缺血再灌注損傷研究進展[J];心血管病學進展;2003年02期

9 李領召,張昱;中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷研究進展[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2003年S1期

10 朱彬,萬朝敏,郭慧玲,肖靜,王正榮;心肌缺血再灌注損傷時心肌肌球蛋白ATP酶活性的改變[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2004年02期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 王彩歌;王永霞;;心肌缺血再灌注損傷研究進展[A];第二屆全國中西醫(yī)結合心血管病中青年論壇暨第二屆黃河心血管病防治論壇資料匯編[C];2011年

2 李長嶺;蔣峻;樊友啟;丁芳;Wieming Fan;Ling Wei;;腫瘤壞死因子a受體1敲除對心肌缺血再灌注損傷作用的研究[A];2006年浙江省內科學學術年會、2006年浙江省老年醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2006年

3 王彩歌;王永霞;;心肌缺血再灌注損傷研究進展[A];2011年中華中醫(yī)藥學會心病分會學術年會暨北京中醫(yī)藥學會心血管病專業(yè)委員會年會論文集[C];2011年

4 陳協(xié)輝;李鵬;黃小平;王東明;陳宋明;楊澤民;陳智凡;許文敏;陳麗萍;;氣體信號分子硫化氫對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[A];中華醫(yī)學會第十五次全國心血管病學大會論文匯編[C];2013年

5 李培軍;;心肌缺血再灌注損傷——基礎與臨床[A];中華醫(yī)學會第一屆重癥心臟全國學術大會暨第二屆西湖重癥醫(yī)學論壇、2013年浙江省重癥醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2013年

6 彭濤;徐明江;滕旭;管又飛;;AZ12417698對大鼠心肌缺血/再灌注損傷保護作用的研究[A];中國生理學會第23屆全國會員代表大會暨生理學學術大會論文摘要文集[C];2010年

7 吳儀;謝中光;;心肌缺血再灌注,有關自由基的幾個問題(簡報)[A];第三次全國急診醫(yī)學學術會議論文摘要匯編[C];1990年

8 辛平;朱偉;李靜;劉銘雅;李京波;Andrew N.Redington;魏盟;;缺血后處理聯(lián)合遠端缺血期處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護的研究[A];中華醫(yī)學會第11次心血管病學術會議論文摘要集[C];2009年

9 吳志明;董麗莉;樊冰;潘翠珍;舒先紅;;斑點追蹤顯像技術評價心肌缺血再灌注對心肌扭轉影響的實驗研究[A];第十屆全國超聲心動圖學術會議論文[C];2010年

10 袁肇凱;黃獻平;曹金枝;胡志希;簡亞平;;心肌缺血再灌注損傷大鼠冠狀微循環(huán)改變的實驗研究[A];中國微循環(huán)學會第五屆中國微循環(huán)學術大會論文摘要匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數據庫 前7條

1 陶春祥;何占德;中藥單體防治心肌缺血/再灌注損傷[N];中國醫(yī)藥報;2004年

2 陶春祥 何占德;中醫(yī)方藥防治MI／R損傷研究[N];中國醫(yī)藥報;2004年

3 廣文;讓心肌重現生機[N];醫(yī)藥經濟報;2003年

4 武開宏;心肌也能再生[N];健康報;2005年

5 ;防治急性心肌缺血再灌注損傷實驗研究通過鑒定[N];中國高新技術產業(yè)導報;2001年

6 江蘇省中醫(yī)藥研究院 李偉　沈明勤 陸曉暉;中藥防治心肌缺血再灌注損傷作用機制探討[N];中國醫(yī)藥報;2011年

7 ;中藥可用于心臟保存[N];中國醫(yī)藥報;2003年

中國博士學位論文全文數據庫 前10條

1 姚恒臣;HMGB1對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及信號傳導通路[D];山東大學;2015年

2 郭小芙;內質網應激在高血壓大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用[D];蘇州大學;2015年

3 高超;TXNIP在心肌缺血再灌注中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

4 趙智剛;蒽貝素對心臟驟停模型中心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D];武漢大學;2015年

5 陳邦黨;CaMEK基因靶向轉導減輕老齡心肌缺血再灌注損傷的機制研究[D];新疆醫(yī)科大學;2015年

6 李俊平;益氣活血安神法通過抑制鈣超載減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的實驗研究[D];中國中醫(yī)科學院;2016年

7 張娟;HMGB1在電針內關穴對心肌缺血再灌注損傷保護作用中的機制研究[D];上海交通大學;2015年

8 吳娜;硝酸酯藥物后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究[D];青島大學;2015年

9 幺天保;維生素D受體在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其機制研究[D];上海交通大學;2014年

10 閆福曼;心肌微環(huán)境誘導間充質干細胞通道蛋白表達及丹參酮的干預作用研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2009年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 袁琪;大鼠心肌缺血再灌注損傷病理機制及STVNa保護作用的蛋白質組學研究[D];華南理工大學;2015年

2 陳輝;法西多曲對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究[D];湖北科技學院;2015年

3 杜勤;咖啡酸對硝基苯乙酯抗大鼠MI/RI作用的蛋白印跡分析[D];西南大學;2015年

4 張宗雷;血清乳脂球表皮生長因子-8在心肌缺血再灌注損傷中的表達及意義[D];濟寧醫(yī)學院;2015年

5 李海勛;PR39與ADM共載體rAAV分泌表達后對心肌缺血再灌注損傷的保護性研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

6 宗巧鳳;內嗎啡肽-1后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D];蚌埠醫(yī)學院;2015年

7 袁樂宏;遠端肢體缺血后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[D];南華大學;2015年

8 白文莉;GYY4137對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2013年

9 吳倩;SIRT1對大鼠心肌缺血再灌注時內質網應激相關凋亡的影響及ERK1/2通路的作用[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

10 保善錄;藏藥四味辣根菜湯散對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[D];青海大學;2016年

，

本文編號：771585