本文關(guān)鍵詞：HMGB1在阿爾茨海默病的小膠質(zhì)細(xì)胞模型中作用的研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病,主要以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙及行為損害為特征。2005年,ADI在《TheLancet))上發(fā)表的“德?tīng)柗茄芯抗沧R(shí)”指出截至2005年全球有2430萬(wàn)癡呆患者,每年還以460萬(wàn)(每7秒1例)的速度上升。每20年增加1倍的患病人數(shù),預(yù)測(cè)到2040年,全球癡呆病例將達(dá)到8110萬(wàn)之多。中國(guó)作為目前世界上癡呆人數(shù)最多且增長(zhǎng)速度最快的國(guó)家。這都給社會(huì)及家庭增加了沉重的經(jīng)濟(jì)及心理負(fù)擔(dān)。 Alzheimer病主要的病理改變是淀粉樣蛋白沉積及神經(jīng)元纖維纏結(jié)。目前病因尚未明確,其主要的假說(shuō)包括,淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō)、tau蛋白假說(shuō)、神經(jīng)血管假說(shuō)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥機(jī)制等多種假說(shuō)。而其中影響較廣的是淀粉樣蛋白瀑布假說(shuō),認(rèn)為Aβ的生成與清除失衡導(dǎo)致過(guò)度沉積是導(dǎo)致神經(jīng)元變性和癡呆的起始事件。目前越來(lái)越多的研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)跑(Microglia)在阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程起到至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可介導(dǎo)炎癥反應(yīng),釋放炎癥因子如IL-1、IL-6及TNF-a等,從而導(dǎo)致神經(jīng)元損害；甚至參與到淀粉樣蛋白的清除,所以不能排除小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬、降解能力下降導(dǎo)致Aβ沉積的可能性。多種因素如衰老、凋亡等均可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞活化,從而引起顱內(nèi)的炎癥反應(yīng)。高遷移率蛋白Bl(high mobility group box-1,HMGB1)是近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的一個(gè)晚期炎癥因子,其參與了敗血癥、腫瘤、急性腦損傷、胰腺炎等多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞外IMGB1通過(guò)與其受體RAGE、 TLR2及TLR4等結(jié)合后觸發(fā)多種信號(hào)途徑,發(fā)揮其致炎效應(yīng)。在顱內(nèi),HMGB1在細(xì)胞因子刺激后可被釋放,并參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。Andrey Mazarati等發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)中,HMGB1的水平是處于升高的狀態(tài),所以認(rèn)為HMGB1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是此類(lèi)神經(jīng)變性疾病的的一個(gè)危險(xiǎn)因素。K. Takata發(fā)現(xiàn)在AD模型腦內(nèi)HMGB1的濃度明顯增加,Ap斑塊周?chē)e聚著較多的HMGB1. HMGB1通過(guò)緊密結(jié)合Aβ42,穩(wěn)定Aβ42的寡聚體狀態(tài),影響小膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ42的能力,同時(shí)增加Aβ42自身的毒性。隨后Takata等于2012年發(fā)現(xiàn)未有HMGB1存在的情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中Aβ1-40比Aβ42更容易降解,但在HMGB1干預(yù)的情況下,小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Aβl-40降解能力明顯下降,從而導(dǎo)致胞外的Aβ40沉積增多。 目前HMGB1在AD的作用機(jī)制尚不明。有研究認(rèn)為,HMGB1通過(guò)與Ap結(jié)合,從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ,或者通過(guò)TLR-4及RAGE途徑造成記憶損傷。那究竟HMGB1在小膠質(zhì)細(xì)胞的作用如何,我們?cè)O(shè)計(jì)本研究：采用1μmol/LAp1-40及0.3μmol/L HMGB1單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)原代小膠質(zhì)細(xì)胞,并且利用抗RAGE抗體進(jìn)行阻斷試驗(yàn),采用ELISA技術(shù)測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-1釋放水平,實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞表面RAGE的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示：Aβ及HMGB1均可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-a、IL-6,但Ap的刺激程度明顯強(qiáng)于HMGB1(P0.05)。HMGB1對(duì)Aβ誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-a、 IL-6無(wú)明顯正反饋�？筊AGE抗體可抑制Ap誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-a及IL-6,考慮Aβ可能通過(guò)結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞表面的RAGE產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。 [材料和方法] 1.材料：剛出生1天內(nèi)的SD乳鼠購(gòu)自中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：SCXK(粵)2011-0029),DMEM/F-12(1：1)培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO)、胎牛血清(FBS)(美國(guó)GIBCO)、0.25%胰蛋白(含0.02%EDTA)(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、L-多聚賴(lài)氨酸(MW：15-30w)(美國(guó)sigma)、多聚甲醛(廣州化學(xué)試劑廠)、抗Iba抗體(英國(guó)Abcam)、 FITC-山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz)、Aβ40(Sigma公司)、高遷移率蛋白B1(HMGB1)(sigma公司)、rRAGE Affinity Purified Goat IgG(RD公司)、六氟異丙醇(HIFP)(美國(guó)sigma)、二甲基亞礬(DMSO)(廣州威佳生物有限公司)、考馬斯亮藍(lán)R250(研域(上海)化學(xué)試劑有限公司)、陽(yáng)極緩沖液(康為世紀(jì))、陰極緩沖液(康為世紀(jì))、Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(康為世紀(jì))、PageRuler Prestained protein ladder(Thermo Scientific)、Rat TNF-alpha ELISA Kit(MultiSciences公司)、Rat IL-6ELISA Kit (MultiSciences公司)、Rat IL-1ELISA Kit(MultiSciences公司),Revertaid first strand cDNA synthesis試劑盒(Thermo Scientific)。 主要儀器：超凈工作臺(tái)(中國(guó),AIRTECH),HEPA Class100二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo Foma)、搖床(中國(guó),Kylin-Bell)、倒置顯微鏡(日本,OLYMAPUS)、激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó),Leica)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó),Beckman)、 Synergy TM HT多通道酶標(biāo)儀(美國(guó),BIO TEK)、 Mini-PROTEAN電泳槽(中國(guó),BIO-RAD)、消毒手術(shù)器械、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó),MJResearch Inc.)、 RT-PCR儀器(美國(guó),Bio-Rad).NANoDROP2000分光光度計(jì)核酸OD檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo SCIENTIFIC) 2.方法： 2.1原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：將剛出生1天內(nèi)的SD乳鼠用75%酒精消毒后固定,取出腦組織,去除腦干,剝離腦膜及血管,置于離心管中剪碎、0.125%胰酶37℃水浴消化、血清終止消化,70μm濾網(wǎng)過(guò)濾、離心、重懸、計(jì)數(shù)后接種至75cm2培養(yǎng)瓶(含15%FBS、1%青鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基)中。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)輕搖后換液,隨后每4天全量換液一次,10天左右后可見(jiàn)明顯的細(xì)胞分層。上層細(xì)胞主要為小膠質(zhì)細(xì)胞及少量的少突膠質(zhì)細(xì)胞,呈圓形,透光性較好,下層細(xì)胞主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元。搖床振搖,180/min,15min,將培養(yǎng)基吸出,收集脫落的細(xì)胞,1500r/s5min離心,去除上清液,加入完全培養(yǎng)基,吹打混勻,計(jì)數(shù),種入6孔板(已放置蓋玻片),37℃5%C02溫箱培養(yǎng)15-30分鐘,更換培養(yǎng)基,即去除延遲貼壁的少突膠質(zhì)細(xì)胞,貼壁細(xì)胞即為純化的小膠質(zhì)細(xì)胞。免疫熒光術(shù)鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞表面的Ibal,陽(yáng)性率大于95%,可用于后續(xù)試驗(yàn)。 2.2Aβ寡聚體的制備：將0.22m1六氟異丙醇(HFIP)(已預(yù)冷)加入到Aβ1-40粉劑(1mg)試劑瓶中,室溫孵育1h,充分溶解Aβ1-40,置在冰上10min左右后移至通風(fēng)櫥內(nèi),待HFIP揮發(fā)風(fēng)干后可見(jiàn)透明的Ap肽膜,加入44μL新鮮無(wú)水100%DMSO溶解,加入DMEM/F12培養(yǎng)液將Ap濃度稀釋成1μmol/L4℃孵育24h后,14000r/min低溫離心10min后取其上清液。分裝后放置在-20℃保存。用上樣緩沖液預(yù)處理Ap進(jìn)行電泳4小時(shí)左右,考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。 2.3建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎性模型：分離純化后小膠質(zhì)細(xì)胞以3×105／孔接種到六孔板中,培養(yǎng)24小時(shí),采取lμmol/LAβ40單體單獨(dú)及聯(lián)合03μmol/LHMGB1干預(yù)組、單獨(dú)給予HMGB1干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞及空白對(duì)照組,即為：Aβ1-40(1μmol/L）、 Aβ1-4O（1μmol/L)+HMGB1(0.3pmol/L）、HMGB1(0.3μmol/L)、Aβ1-40(1μmol/L)+抗RAGE抗體(提前1h處理)、Aβ1-40(lμmol/L)+HMGB1(0.3gmol/L)+抗RAGE抗體(提前1h處理)、空白組(不加任何藥物),分別培養(yǎng)6小時(shí)、24小時(shí)收集上清液,檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6及IL-1釋放水平。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。 2.4進(jìn)行上述操作處理,培養(yǎng)24h后棄去上清液,利用TRIZOL法提取Aβ1-40（1μmol/L)、 Aβ1-40(1μmol/L)+HMGB1(0.3nmol/L)、HMGB1(0.3μmol/L）、空白組(不加任何藥物)各組的總RNA并測(cè)定RNA濃度,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄呈cDNA,采用熒光定量PCR檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞表面RAGE的表達(dá)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法ELISA及PCR結(jié)果為計(jì)量資料,均采用x±s表示,采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),ELISA數(shù)據(jù)采用析因分析,PCR數(shù)據(jù)采用方差分析,組間比較采用LSD進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。 [結(jié)果] 1.原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、分離及鑒定：倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞部分呈圓形或類(lèi)圓形,另有呈現(xiàn)梭狀,有伸出突起；采用免疫熒光術(shù)鑒定純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞,胞質(zhì)Iba的陽(yáng)性率在95%以上。 2.各組上清液TNF-a濃度的測(cè)定：各實(shí)驗(yàn)組間TNF-a濃度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=57.128,P=0.000)。Aβ1-40組、Aβ1—40+HMGB1組、HMGB1組、Ap1-40+抗RAGE抗體組、Aβ1—40+HMGB1+抗RAGE抗體組的TNF-a濃度均高于空白對(duì)照組,Aβ1-40組的TNF-a濃度高于Aβ1-40+抗RAGE等其余各組,Aβ1—40+HMGBl組高于Aβ1—40+HMGBl+抗RAGE抗體組(P=0.000),HMGB1與各組間TNF-a濃度比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。同一處理方法,不同時(shí)間點(diǎn)間上清液中TNF-a濃度比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,24h時(shí)收集的上清液TNF-a濃度低于6h時(shí)收集的上清液中TNF-a濃度(F=209.122,P=0.000)。 3.各組上清液中IL-6濃度的測(cè)定值：各實(shí)驗(yàn)組上清液中IL-6濃度比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=18.102,P=0.000).Aβ1-40組、Aβ1-40+HMGB1組、HMGB1組的IL-6濃度均高于空白對(duì)照組,同時(shí),Aβ1-40組濃度高于Aβ1-40+抗RAGE抗體組,Aβ1-40+HMGB1組高于Aβ1-40+HMGBl+抗RAGE抗體組(P=0.000),HMGB1干預(yù)組與各組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Aβ1-40組除外)(P0.05)。同一處理方法,不同時(shí)間點(diǎn)間上清液中IL-6濃度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.177,P=0.678)。 4.各組上清液中IL-1p濃度的測(cè)定值：各實(shí)驗(yàn)組上清液中IL-1p濃度比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=51.019,P=0.000)。Ap1-40組、Aβ1-40+HMGB1組、Ap1-40+抗RAGE抗體組、Aβ1-40+HMGB1+抗RAGE抗體組的IL-1p濃度均高于空白對(duì)照組。Aβ1-40組濃度高于Aβ1-40+抗RAGE抗體組(P=0.000),Aβ1-40+HMGB1組IL-1β濃度高于其余各實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組,HMGB1組的IL-1p濃度低于各實(shí)驗(yàn)組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。同一處理方法,不同時(shí)間點(diǎn)間上清液中IL-1p濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=33.087,P=0.000),24h時(shí)收集的上清液高于6h時(shí)收集的上清液的IL-1p濃度。 5.各實(shí)驗(yàn)組Aβ、Aβ+HMGB1及HMGB1小膠質(zhì)細(xì)胞表面RAGE mRNA表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組的RAGEmRNA表達(dá)水平高于空白對(duì)照組的RAGE mRNA表達(dá)水平,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=I.385,P=0.316)。 [結(jié)論] 1.考馬斯亮藍(lán)染色法可直觀、簡(jiǎn)易地檢測(cè)Ap分子量的大小、鑒定Ap的聚集形態(tài)。 2.Ap及HMGB1均可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng),但Ap的刺激程度明顯強(qiáng)于IIMGB1。HMGB1對(duì)Ap誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)物無(wú)明顯協(xié)同作用。 3.抗RAGE抗體可抑制Aβ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 炎癥 小膠質(zhì)細(xì)胞 A β1-40 高遷移率蛋白B1(HMGB1)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-26
• 第一章 原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、純化及鑒定26-35
• 1. 材料26-29
• 2. 方法29-30
• 3. 結(jié)果30-32
• 4. 討論32-35
• 第二章 Aβ40寡聚體的制作及鑒定35-41
• 1. 材料和方法35-36
• 2. 方法36-38
• 3. 結(jié)果38-39
• 4. 討論39-41
• 第三章 HMGB1及其受體在AD小膠質(zhì)細(xì)胞病變模型中的作用41-56
• 1. 材料和方法41-47
• 2. 結(jié)果47-52
• 3. 討論52-55
• 4. 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 縮略詞表62-63
• 攻讀學(xué)位期間成果63-64
• 致謝64-66
• 附件66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：768224