本文關鍵詞：SIRT1在慢性不可預知應激致小鼠抑郁樣行為改變中的作用

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【摘要】：研究背景抑郁癥是一種常見的精神、心理疾病,嚴重影響患者的正常生活和身心健康,也給患者家庭帶來沉重負擔。當前全球抑郁癥患者達3.5億,世界衛(wèi)生組織(WHO)預計到2020年抑郁癥將躍居世界疾病負擔的第二位。在過去的幾十年里,人們對抑郁癥相關的分子、細胞和信號通路做了很多的探索,但是引起抑郁癥發(fā)病的機制尚未明確,同時有效的抗抑郁治療方法發(fā)展緩慢,臨床治療效果并不理想,因此抑郁癥的探究任重道遠。現(xiàn)實生活中很多人面臨著來自工作、學習和家庭等各方面的壓力,使人經(jīng)常處于一種應激的狀態(tài)。長期的不良應激可能會引起情感、認知和生理方面的障礙,提高機體患抑郁癥的風險,因此慢性應激是引起抑郁癥發(fā)病的重要因素。有關應激性抑郁癥的機制人們也做了很多的探索,并發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質,信號通路,鋅缺乏和細胞因子等方面的變化與抑郁癥關系密切,其中免疫功能紊亂可能是抑郁癥發(fā)病的重要誘因。臨床研究發(fā)現(xiàn),與正常人群比,抑郁癥患者體內的炎性細胞因子顯著升高。同時發(fā)現(xiàn)給予抗抑郁藥可以改善機體的炎癥水平,如選擇性血清素再吸收抑制劑(SSRIs)能明顯抑制炎性因子的作用,使炎性細胞因子釋放減少,如TNF-α、IFNγ、IL-1β等。但是應激性抑郁癥為什么常伴隨著機體炎癥水平升高,以及免疫應答引起的功能異常在抑郁癥的發(fā)病過程中的作用機制仍是不明確的,還有待進一步研究。在應激誘發(fā)抑郁癥的過程中,小膠質細胞被激活是關鍵環(huán)節(jié),在眾多研究中抑郁癥也被認為是一種小膠質細胞疾病。神經(jīng)膠質細胞對于維持正常的腦功能有關鍵作用,而小膠質細胞與動物行為又密切相關,因此小膠質細胞是研究神經(jīng)炎癥,神經(jīng)退行性疾病及抑郁癥的重要靶點。但是應激激活小膠質細胞炎癥反應的機制是不明確的,特別是在應激誘發(fā)抑郁癥的過程,這也是我們本課題關注的重點。基于以往的研究,我們推測應激引起的炎癥可能是一種非感染性的代謝性炎癥反應,代謝紊亂引起的代謝性炎癥的發(fā)生,可能涉及調節(jié)代謝的關鍵蛋白SIRT1。SIRT1的編碼基因位于染色體10q22.1,依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)發(fā)揮脫乙酰化作用,是機體關鍵的“代謝感受器”。SIRT1通過與多種參與應激反應的轉錄子相互作用影響細胞的分化、細胞凋亡、腫瘤的發(fā)生以及機體代謝過程。同時,SIRT1能夠通過抑制Akt/GSK3,NF-κB等多條細胞信號通路發(fā)揮抗炎作用,有證據(jù)證明SIRT1參與調節(jié)神經(jīng)元的分化,可以有效預防神經(jīng)退行性病變,具有神經(jīng)保護作用。Taro Kishi等在日本人群中的調查也發(fā)現(xiàn)SIRT1基因表達與重度抑郁癥(major depressive disorder,MDD)可能相關的現(xiàn)象,這提示SIRT1功能下降可能是抑郁癥發(fā)病的重要機制,這也為我們本課題的研究奠定了基礎。綜上所述,炎癥反應可能是抑郁發(fā)病的重要影響因素,但炎癥反應的變化機制并不明確。因此,探索SIRT1與抑郁癥的關系,炎癥和抑郁癥的關系,以及SIRT1如何調控應激性炎癥反應,對于抑郁癥的研究進展有重要意義。實驗目的本研究通過慢性不可預知應激建立BABL/c小鼠抑郁模型,并利用SIRT1的激活劑白藜蘆醇干預抑郁小鼠,觀察應激小鼠腦組織中SIRT1表達與抑郁樣行為之間的關系,并初步檢測SIRT1調控的信號通路的變化。最后,在細胞水平進一步驗證SIRT1對BV2小膠質細胞炎癥反應的調控及相關機制,希望能為抑郁癥的機制研究及臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。實驗方法1、建立小鼠抑郁模型雄性BABL/c小鼠(購自上海西普爾必凱公司),體重(20±2)g。根據(jù)體重隨機分為5組,分別為對照組(Con)、應激35天組(Stress)、應激加白藜蘆醇給藥組(Stress+Res)、白藜蘆醇給藥組(Res)、DMSO溶劑對照組(DMSO)。在糖水適應兩周后,每天在不固定的時間采用一種應激方法干預小鼠,共有7種隨機排序的應激方法,分別是束縛應激2h、墊料打濕24h、搖晃10min、鼠籠傾斜24h左右、飲食剝奪24h、45℃烘箱熱應激5min、4℃水游泳冷應激5min。每隔七天晚上進行一次糖水偏愛實驗,應激5周后測定小鼠的行為學指標(自發(fā)活動實驗和懸尾實驗)。行為學實驗結束后稱重,小鼠處死后采集血清、海馬、前額皮質等組織標本備用,取附睪脂肪并稱重。2、小鼠行為學指標的測定(1)糖水偏愛實驗(Sucrose preference test)在糖水適應階段,每籠小鼠分別放兩個1%(w/v)的蔗糖水瓶。每隔7天晚上固定時間(21:00~22:00)做糖水偏愛實驗。每只小鼠單獨放在一個鼠籠,一瓶自來水,一瓶蔗糖水,測定在1h時間內喝水量。統(tǒng)計小鼠的糖水偏愛分數(shù):糖水/(糖水+自來水)%s100%。(2)自發(fā)活動(Spontaneous Activities)把小鼠放在自發(fā)活動儀器暗箱底部中間位置,箱頂安裝攝像裝置,記錄小鼠在5min內的運動情況,通過Ethovision XT軟件處理記錄的運動圖像,分析小鼠運動的平均速度。(3)懸尾實驗(TST)用醫(yī)用膠帶將小鼠尾尖固定在測試箱的重力傳感器上,正式實驗開始前先觀察一只小鼠處于不動狀態(tài)時的數(shù)值,該數(shù)值設為閾值,并記錄小鼠在6min內的不動時間,取后5min內的不動時間統(tǒng)計分析。3、免疫熒光標記先將石蠟切片脫蠟沖洗,用EDTA緩沖液修復,3%過氧化氫溶液孵育10min后,用5%BSA封閉20min,封閉結束后加入50μl稀釋的SIRT1抗體(1:2000)、Iba-1抗體(1:2000),抗體孵育過夜。24h后二抗避光孵育1h后,每張切片加50-100μL DAPI,避光染核5min,稍后用封片劑封片,放在4℃保存,注意避光。4、小鼠腦組織尼氏染色用4%的多聚甲醛將小鼠腦組織固定,包埋石蠟,切片(4μm),將切片的組織浸泡在1%的甲苯胺藍中,50°C染色20min,之后用雙蒸水沖洗干凈并固定,用熒光顯微鏡觀察切片并采集圖像。5、細胞的培養(yǎng)及干預小鼠BV2細胞株,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)較好時,將細胞傳代至六孔板中,按照一定的時間順序分別用IFNγ、Res、NAM干預細胞。干預結束后收集細胞和細胞培養(yǎng)基備用。6、ELISA測小鼠血漿及細胞培養(yǎng)基中細胞因子收集小鼠血漿和細胞培養(yǎng)基上清,根據(jù)affymetrix e Bioscience ELISA試劑盒說明書操作,檢測小鼠血漿和細胞培養(yǎng)基上清中TNF-α和IFNγ的濃度。7、Western-blot用RIPA裂解液提取腦組織和細胞的總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,100°C 10min完成蛋白變性。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5h,轉膜1.5h,封閉2h,孵育一抗過夜,漂洗8min 3次,孵育二抗1.5h,漂洗8min 3次后,顯影,條帶采用Image J圖像分析軟件進行灰度分析。8、統(tǒng)計方法使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析,Excel 2007和graph Pad整理數(shù)據(jù)和繪制圖表,用Image J軟件分析Western條帶灰度值。統(tǒng)計方法為兩獨立樣本t-檢驗,結果以P0.05為顯著性水平,P0.01為非常顯著性水平。實驗結果1、應激35D成功建立小鼠抑郁模型(1)應激對小鼠行為的影響慢性不可預知應激35天后,與Con組比較,Stress組小鼠出現(xiàn)行為學變化,三個行為學指標差異均具有統(tǒng)計學意義。糖水偏愛實驗(Sucrose preference test)中,Stress組糖水偏愛分數(shù)顯著低于Con組(P0.01);懸尾實驗(TST)中,與Con組比較,Stress組5min內不動時間延長(P0.05);自發(fā)活動實驗(Spontaneous activity)中,5min內Stress組小鼠運動平均速度下降(P0.05)。(2)應激對小鼠體重的影響結果表明,慢性不可預知應激35天后,與Con組比較,Stress組小鼠體重降低,且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。慢性不可預知應激5周后,與Con組比較,Stress組小鼠附睪周圍脂肪與體重的比值下降,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、激活SIRT1的表達改善應激小鼠抑郁樣行為和炎癥水平(1)激活SIRT1對小鼠抑郁樣行為的影響從應激第3周開始,每天給予小鼠25mg/kg劑量Res,應激35天時抑郁小鼠的行為學指標(糖水偏愛實驗、自發(fā)活動實驗和懸尾實驗)得到改善,恢復到對照組水平。(2)Res對應激小鼠前額皮質及海馬中SIRT1、AMPK、GSK3β蛋白表達的影響與Con組相比,應激35天小鼠前額皮質和海馬中的SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表達顯著下降,GSK3β表達升高。與Stress組相比,Stress+Res組SIRT1、p-SIRT1、AMPK、p-AMPK表達升高,GSK3β表達下降,恢復到對照組水平。(3)Res對應激小鼠腦組織小膠質細胞中SIRT1的影響應激35天后,小鼠腦組織中的小膠質細胞數(shù)量顯著增加,說明慢性應激會激活小膠質細胞。同時應激組神經(jīng)元中SIRT1含量下降,而給予Res可以抑制SIRT1的下降。Iba-1與SIRT1雙標結果顯示,Stress組小膠質細胞中SIRT1含量下降。Stress+Res組小膠質細胞中的SIRT1恢復到正常水平,提示小鼠抑郁樣行為的改善可能與激活SIRT1的表達相關。(4)激活SIRT1對應激小鼠腦組織形態(tài)學的影響尼氏染色結果顯示,尼氏小體呈三角形或橢圓型塊狀,顏色為紫藍色。慢性不可預知應激使皮層和海馬CA3區(qū)神經(jīng)元尼氏小體顯著減少,細胞壁變薄,說明慢性不可預知應激引起了神經(jīng)元的損傷。同時染色結果顯示,Stress+Res組小鼠前額皮質和海馬中的尼氏小體恢復到對照組數(shù)量和狀態(tài)。(5)激活SIRT1對應激小鼠血漿中TNF-α、IFNγ濃度的影響ELISA結果顯示,與Con組比較,小鼠在應激35天后血漿中TNF-α和IFNγ炎性因子濃度升高,差異具有統(tǒng)計學意義;而與Stress組比較,Stress+Res組小鼠血漿中IFNγ和TNF-α炎性細胞因子濃度下降,差異有統(tǒng)計學意義。3、SIRT1通過抑制GSK3β調控小膠質細胞炎癥反應(1)IFNγ激活BV2小膠質細胞用25 ng/ml IFNγ分別干預BV2細胞24h、48h和72h,Western blot結果顯示,IFNγ干預24h,BV2細胞中SIRT1、AMPK蛋白表達下降,而GSK3β蛋白表達增加。(2)Res激活SIRT1蛋白表達Western blot結果顯示,用20μM Res干預BV2細胞24h,可以激活SIRT1蛋白的表達,而且Res對SIRT1的激活作用是劑量依賴性的,當干預濃度超過一定范圍時,Res對SIRT1的激活作用逐漸減弱。(3)NAM抑制SIRT1蛋白表達用30m M NAM干預BV2細胞24h可以抑制SIRT1蛋白的表達,用IFNγ、Res、NAM同時干預細胞發(fā)現(xiàn),NAM會抑制Res對SIRT1的激活作用。(4)SIRT1對細胞培養(yǎng)基中TNF-α、IFNγ濃度的影響ELISA結果顯示,與Con組比較,25 ng/ml IFNγ干預BV2細胞會增加TNF-α和IFNγ的釋放,使其濃度升高,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);與IFNγ組比較,IFNγ+Res組TNF-α和IFNγ濃度顯著下降,且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),提示用Res干預BV2小膠質細胞可以抑制TNF-α和IFNγ的釋放。結論本實驗通過慢性不可預知應激建立BABL/c小鼠抑郁模型,并通過激活SIRT1改善小鼠的抑郁樣行為和炎癥水平,初步驗證了SIRT1在抑郁癥的作用機制,得出如下結論:1、慢性不可預知應激5周后,小鼠表現(xiàn)出典型的抑郁樣行為,模型建立成功。2、SIRT1表達下降可能是應激組小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為的原因之一。3、激活SIRT1的表達會抑制GSK3β的表達,提示SIRT1可能通過抑制GSK3β發(fā)揮抑炎作用。4、慢性應激會引起神經(jīng)元損傷,而激活SIRT1的表達可以改善小鼠的神經(jīng)元形態(tài),表明SIRT1有保護神經(jīng)元的作用。5、SIRT1可通過抑制小膠質細胞GSK3β發(fā)揮抑炎作用。綜上說明,SIRT1是機體代謝性炎癥反應的重要調節(jié)因子,應激時SIRT1表達下降,激活SIRT1的表達會抑制GSK3β而起到抑制炎癥反應的作用,并改善小鼠抑郁樣行為。
【關鍵詞】：慢性不可預知應激 SIRT1 白藜蘆醇(Res) AMPK GSK3β TNF-α
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-17
• 英文縮略詞表17-18
• 前言18-21
• 參考文獻19-21
• 第一部分 小鼠抑郁模型的建立及腦組織SIRT1蛋白表達的變化21-37
• 一、材料與方法21-28
• 二、結果28-33
• 三、討論33-35
• 參考文獻35-37
• 第二部分 激活SIRT1對應激小鼠抑郁樣行為和炎癥水平的影響37-51
• 一、材料與方法37-39
• 二、結果39-47
• 三、討論47-49
• 參考文獻49-51
• 第三部分 SIRT1通過抑制GSK3β 調控小膠質細胞炎癥反應51-62
• 一、材料與方法51-54
• 二、結果54-59
• 三、討論59-60
• 參考文獻60-62
• 全文總結62-63
• 綜述63-73
• 參考文獻68-73
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況73-74
• 致謝74

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本文編號：760468