本文關(guān)鍵詞：人脆性X智力障礙蛋白FMRP氨基端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能研究

  更多相關(guān)文章： 脆性X綜合征 X射線晶體學(xué) FMRP KH0 二聚化 組蛋白修飾

【摘要】：脆性X綜合征(Fragile X Syndrome, FXS)是人類最常見的遺傳性智力缺陷疾病。脆性X智力障礙蛋白(Fragile X Mental Retardation Protein, FMRP)的缺失是FXS的發(fā)病原因。FMRP通過選擇性結(jié)合RNA參與RNA代謝的不同過程。對(duì)FMRP研究最多的是其在翻譯調(diào)控中的作用。研究人員已提出了三種FMRP抑制翻譯的模型,但也有報(bào)道稱FMRP能夠在翻譯激活中發(fā)揮作用。FMRP在細(xì)胞內(nèi)缺失后,某些mRNA的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)或穩(wěn)定性失調(diào),導(dǎo)致許多神經(jīng)通路產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng),最終導(dǎo)致FXS。在分子水平上,FMRP通過其中部的兩個(gè)KH結(jié)構(gòu)域和C端的Arg-Gly-Gly (RGG)盒子識(shí)別RNA,如鳥嘌呤四聯(lián)體RNA。然而,就FMRP的結(jié)構(gòu)和功能而言,在其N端結(jié)構(gòu)域仍存在若干基本問題。首先,FMRP N端的135-217位氨基酸殘基部分涉及其與多種蛋白或核酸的互作,但是結(jié)構(gòu)仍未被解析。另外,FMRP N端結(jié)構(gòu)域的寡聚性質(zhì)與其在細(xì)胞內(nèi)的功能相關(guān),然而機(jī)理尚不清楚。最近有報(bào)道稱,FMRP N端結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合染色質(zhì)在DNA損傷響應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但FMRP是否以及如何識(shí)別某種組蛋白翻譯后修飾均未被解答。本論文經(jīng)過篩選不同氨基酸殘基長度和結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)的截短體蛋白,采用原核表達(dá)和純化獲得人源FMRPN端蛋白,使用固定沉淀劑的分子印跡聚合物(piMIPs)作為成核劑得到FMRP1-209的高質(zhì)量晶體,運(yùn)用分子置換法解析其三維結(jié)構(gòu)(簡稱為FMRP-NT)。晶體結(jié)構(gòu)顯示,FMRP-NT由三個(gè)結(jié)構(gòu)域和兩條結(jié)構(gòu)域間的長loop構(gòu)成,三個(gè)結(jié)構(gòu)域呈近似線性的排列。本論文發(fā)現(xiàn)FMRP-NT的127-200殘基部分是一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)比對(duì)揭示它是KH結(jié)構(gòu)域的一種新亞型,本論文將其命名為KHO。因?yàn)樵诘湫偷腒H結(jié)構(gòu)域中高度保守的RNA識(shí)別基序"GXXG"和兩個(gè)異亮氨酸在KHO中不存在,所以本論文推測它有與其他KH結(jié)構(gòu)域不同的功能。本論文還發(fā)現(xiàn),在FMRP-NT晶體結(jié)構(gòu)的一個(gè)不對(duì)稱單元中存在兩個(gè)分子間二硫鍵Cys99-Cys99,每個(gè)二硫鍵介導(dǎo)兩個(gè)FMRP-NT分子間形成一個(gè)小疏水界面。本論文首次解析了FMRP N末端結(jié)構(gòu)域Tudorl和Tudor2的晶體結(jié)構(gòu),通過將其分別與已報(bào)道的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的NMR結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比,證明piMIPs沒有改變其結(jié)構(gòu),因此將piMIPs應(yīng)用于FMRP-NT的晶體優(yōu)化是有效的。分析FMRP-NT整體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),Tudorl結(jié)構(gòu)域的一些殘基通過介導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域間及結(jié)構(gòu)域和loop間的相互作用在穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中扮演重要角色。FMRP-NT野生型及其基于結(jié)構(gòu)分析的突變體的凝膠過濾層析實(shí)驗(yàn)、分析超速離心實(shí)驗(yàn)和X射線小角散射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,FMRP-NT在溶液中存在不同形式的二聚體,Ile106是FMRP-NT在溶液中二聚化的關(guān)鍵位點(diǎn)�；谖墨I(xiàn)報(bào)道及FMRP-NT的結(jié)構(gòu)信息,本論文進(jìn)行FMRP識(shí)別組蛋白翻譯后修飾的研究。微量熱泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)和等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)證明FMRP N端結(jié)構(gòu)域與含有三位點(diǎn)修飾的一段組蛋白H4多肽(E320)存在較強(qiáng)結(jié)合,本論文進(jìn)一步通過截短E20進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E20多肽C端不帶修飾的10個(gè)氨基酸殘基對(duì)其與FMRP N端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是必需的。本論文的結(jié)果表明,FMRP N端包含一個(gè)新亞型的KH結(jié)構(gòu)域KHO; FMRP N端結(jié)構(gòu)域在溶液中以多種二聚體形式存在并能夠結(jié)合含有修飾的組蛋白多肽。這些發(fā)現(xiàn)為闡明FMRP在細(xì)胞中的功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：脆性X綜合征 X射線晶體學(xué) FMRP KH0 二聚化 組蛋白修飾
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 引言11-32
• 1.1 FMRP的研究進(jìn)展11-20
• 1.2 組蛋白翻譯后修飾的研究進(jìn)展20-30
• 1.3 本論文的研究目的及意義30-32
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法32-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料32-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-47
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析47-75
• 3.1 重組FMRP的表達(dá)和純化實(shí)驗(yàn)揭示其N末端結(jié)構(gòu)域可進(jìn)行晶體學(xué)研究47-51
• 3.2 蛋白晶體培養(yǎng)、優(yōu)化和結(jié)構(gòu)解析揭示FMRP-NT晶體結(jié)構(gòu)51-57
• 3.3 FMRP-NT晶體結(jié)構(gòu)分析揭示一種新亞型KH結(jié)構(gòu)域KH057-59
• 3.4 Tudorl結(jié)構(gòu)域在維持FMRP-NT整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用59-61
• 3.5 基于晶體結(jié)構(gòu)對(duì)FMRP-NT在溶液中二聚化機(jī)理的研究61-68
• 3.6 FMRP結(jié)合一條含三個(gè)翻譯后修飾的組蛋白多肽68-75
• 第四章 討論75-83
• 4.1 piMIPs不改變FMRP-NT的晶體結(jié)構(gòu)75-76
• 4.2 FMRP含有一種新亞型KH結(jié)構(gòu)域KH076-79
• 4.3 FMRP的半胱氨酸79-83
• 第五章 結(jié)論83-84
• 參考文獻(xiàn)84-91
• 致謝91-92
• 個(gè)人簡歷92

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本文編號(hào)：757279