本文關(guān)鍵詞：慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙及機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 抑郁 海馬 糖皮質(zhì)激素 糖皮質(zhì)激素受體 凋亡 自噬 死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1) 胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK) 核糖體S6激酶1(RSK1) 空間學(xué)習(xí)記憶

【摘要】：背景：抑郁是一種常見的神經(jīng)精神疾病,以持久而顯著的心境障礙為主要特征,患者不僅出現(xiàn)情緒紊亂、睡眠障礙、食欲不佳,而且出現(xiàn)包括注意力、學(xué)習(xí)能力、記憶能力、決策能力、執(zhí)行能力等方面的認(rèn)知功能障礙。世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示,全球約有3.5億名患者,其中每年自殺死亡人數(shù)約100萬人,已經(jīng)成為世界第四大疾病。此外,抑郁也是重要的神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的重要危險(xiǎn)因素之一。 抑郁由社會(huì)、生理、心理等多因素相互作用而導(dǎo)致,其中應(yīng)激是抑郁發(fā)病的重要誘因。神經(jīng)影像學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)抑郁患者前額葉皮層、杏仁核、海馬等變小,并隨著病程的延長、抑郁的反復(fù)發(fā)作而更為顯著。尸檢結(jié)果也證實(shí)了抑郁患者海馬、杏仁核、前額葉皮層等腦區(qū)的萎縮。海馬是承擔(dān)空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū),也參與情緒調(diào)節(jié),其在抑郁發(fā)病過程中的作用備受關(guān)注。而空間學(xué)習(xí)能顯著增加海馬神經(jīng)元數(shù)量、提高海馬相關(guān)的認(rèn)知能力。抑郁患者下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic.pituitary-adrenal axis,HPA axis)功能紊亂明顯,并伴有血清糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)水平升高。GC是機(jī)體重要的一大類應(yīng)激激素,短期內(nèi)升高可以幫助機(jī)體抵御外界刺激,而持續(xù)升高則對機(jī)體產(chǎn)生不利影響。海馬富含糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid reeeptor,GR),尸檢發(fā)現(xiàn)抑郁患者海馬中GR的mRNA和蛋白水平均有下降。以上研究提示海馬在抑郁病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,但是抑郁發(fā)病中海馬損傷的機(jī)制仍不清楚,而改善海馬功能能否改善抑郁癥狀等關(guān)鍵科學(xué)問題有待深入研究。 死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase1,DAPK1)通過不同的途徑參與多種腦疾病(如腦卒中、AD)中的神經(jīng)元損傷：在腦卒中發(fā)生過程中,DAPK1激活并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡；在AD發(fā)生過程中,DAPK1激活并通過過度磷酸化微管相關(guān)蛋白tau而引起神經(jīng)元退行性變性。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶/核糖體S6激酶1(Extracellular signal-regulated protein kinase/ribosomal S6kinase1, ERK/RSK1)是拮抗其損傷的重要信號(hào)分子。DAPK1是否參與抑郁發(fā)病、海馬損傷與DAPK1激活有什么聯(lián)系,這些問題至今尚無研究報(bào)道。 目的：研究慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠是否出現(xiàn)海馬損傷,明確抑郁大鼠海馬損傷的機(jī)制,研究提高抑郁大鼠海馬功能是否能改善抑郁癥狀。 方法：選取3月齡雄性SD大鼠,每天隨機(jī)給予某一種刺激,包括束縛2小時(shí)、夜間照明、禁食24小時(shí)、禁水24小時(shí)、高溫(45℃)、冰水游泳(4℃)、夾尾、足底電擊(電流強(qiáng)度0.5mA),總共21天。大鼠刺激前后都應(yīng)用曠場、強(qiáng)迫游泳、糖水偏好實(shí)驗(yàn)評價(jià)大鼠抑郁程度,并篩選造模成功的抑郁大鼠,然后使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶是否受損。使用Bruker小動(dòng)物磁共振成像儀在體檢測應(yīng)激后大鼠海馬體積。采用Nissl染色檢測大鼠海馬的神經(jīng)元數(shù)量,Golgi染色檢測樹突棘數(shù)量及分類。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測應(yīng)激后大鼠血清和海馬皮質(zhì)酮水平。通過免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)檢測糖皮質(zhì)激素受體及相關(guān)分子在海馬的變化。為觀察改善海馬功能對抑郁行為的影響,我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學(xué)習(xí),學(xué)習(xí)結(jié)束后進(jìn)行抑郁相關(guān)行為學(xué)及生化、形態(tài)學(xué)檢測。為研究抑郁大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少的機(jī)制,我們通過免疫印跡檢測了GC(10-4M)處理的N2a細(xì)胞、GC(10-4M)處理的下調(diào)DAPK1的N2a細(xì)胞、上調(diào)DAPK1的N2a細(xì)胞中DAPK1、ERK、RSK1活性及凋亡與自噬相關(guān)分子的變化。 結(jié)果：應(yīng)激后的大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減弱,在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間明顯延長,在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水消耗百分比降低31.6%,說明慢性應(yīng)激能夠誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中,對照大鼠第5、6天尋找平臺(tái)的潛伏期分別為13.1秒和12.8秒,而且在第7天的檢測中首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期為13.2秒、60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)為3.1次。與對照大鼠相比,抑郁大鼠第5、6天大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期顯著增加,分別為28.4秒和26.2秒；在第7天的檢測中首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期顯著增加,為23.8秒；60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少,為1.7次。在第14天的檢測中,抑郁大鼠首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期為36.1秒,顯著高于對照大鼠(12.5秒),并且在60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)為1.6次,顯著低于對照大鼠(3.9次)。以上數(shù)據(jù)說明抑郁大鼠不僅短期記憶能力受損,長期記憶能力也同樣受損。 長時(shí)程增強(qiáng)(Long term potentiation, LTP)是學(xué)習(xí)記憶的功能學(xué)基礎(chǔ)。本研究中通過刺激內(nèi)嗅區(qū)前穿質(zhì)纖維(Perforant path,PP)并記錄海馬齒狀回(Dentate gyrus, DG)即PP-DG通路的LTP。抑郁大鼠興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)斜率第55-60分鐘降低至對照組的67.9%,第85-90分鐘降低至對照組的69.4%,說明抑郁大鼠海馬LTP的誘導(dǎo)障礙。磁共振成像檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬體積比對照組減少18.9%。Nissl染色顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比對照大鼠相應(yīng)區(qū)域分別減少18.8%、21.2%、18.9%。Golgi染色后顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)樹突棘數(shù)量分別減少31.1%、37.1%、41.6%,蘑菇型樹突在CA1、CA3、DG區(qū)所占比例分別下降46.7%、48.1%、52.4%。以上結(jié)果說明抑郁大鼠出現(xiàn)了海馬結(jié)構(gòu)與功能障礙。 進(jìn)一步通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠血清和海馬組織中皮質(zhì)酮水平分別升高169.7%、116.5%；免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬GR水平減少21.9%、其Ser21l位點(diǎn)磷酸化程度(pS211-GR)減少了30.4%。大鼠腦片免疫組織化學(xué)染色顯示了GR、pS211-GR同樣的變化趨勢。提示GR活性降低。 為研究DAPK1在抑郁大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用及機(jī)制,通過免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬DAPK1增加193%；ERK總量減少27.3%,ERK磷酸化(p-ERK)水平降低88.2%,提示ERK活性下降；RSKl總量下降37.8%,pS380-RSK下降64.5%,提示RSK1活性下降；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3, Caspase3)增加60.8%、Caspase3剪切片段增加193.2%,提示凋亡激活；Beclinl增加52.5%、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ (Microtubule-associated protein light chain3Ⅱ,LC3Ⅱ)增加45.7%,提示自噬體形成增多。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)DAPK1著色程度變深,海馬CA1、CA3、DG區(qū)DAPK1分別增加143.7%、72.9%、91.5%,并且DAPKl在神經(jīng)元內(nèi)的分布發(fā)生改變,由神經(jīng)元突起轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元胞體中。抑郁大鼠海馬CA1、CA3區(qū)ERK分別降低18.7%、28.9%；海馬CAl、CA3區(qū)p-ERK水平分別降低47.6%、38.4%。 體外用糖皮質(zhì)激素(10-4M)處理N2a細(xì)胞24小時(shí)后,與無GC處理的細(xì)胞相比,DAPK1增加56.5%、Caspase3總量增加180.3%、Casspase3剪切片段增加119.9%、Beclinl增加192.6%、LC3Ⅱ增加50.3%、ERK總量減少40.6%、p-ERK降低68.6%、RSK1總量下降28.2%、pS380-RS K減少68.6%。 N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siDAPK1質(zhì)粒48小時(shí),GC(10-4M)處理24小時(shí),與質(zhì)粒載體對照組比較DAPK1表達(dá)降低70.4%、ERK總量增加46.4%、p-ERK增加134.6%、RSK1總量增加119.0%、pS380-RSK增加49.1％. Caspasg3總量減少68.9%Caspase3剪切片段減少68.6%、Beclinl減少77.5%、LC3總量減少26.4%、LC3Ⅱ減少49.3%。 與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的對照組比較,N2a細(xì)胞中過表達(dá)DAPK1質(zhì)粒48小時(shí)后,DAPK1表達(dá)增加70.4%、ERK總量減少75.5%、p-ERK減少63.7%、RSK1總量減少59.0%、pS380-RSK減少81.5%。以上研究結(jié)果提示應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素水平升高可顯著激活DAPK1、進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、自噬體增加；同時(shí),DAPK1激活抑制了ERK和RSK1活性,減少了ERK和RSK1對DAPK1誘導(dǎo)凋亡的拮抗作用。 為進(jìn)一步證實(shí)海馬在抑郁進(jìn)程中的重要性,我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練,經(jīng)過7天空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠在水迷宮中尋找平臺(tái)的潛伏期顯著降低,在曠場試驗(yàn)中5分鐘內(nèi)的穿越的總格子數(shù)(水平得分)為66.2,比學(xué)習(xí)前顯著增加；雙上肢上抬攀爬箱壁次數(shù)(垂直得分)為15.08次,比學(xué)習(xí)前顯著增加；運(yùn)動(dòng)總路程為14.37米,比學(xué)習(xí)前顯著增加。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠在水中的靜止時(shí)間由154.3秒縮短為74.8秒,比學(xué)習(xí)前顯著減少。糖水偏好實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠糖水消耗百分比為75.9%,比學(xué)習(xí)前的46.5%有明顯增加,說明其抑郁樣的行為有明顯改善。而未經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠的上述行為學(xué)觀察指標(biāo)無顯著變化。 Golgi染色研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)樹突棘密度分別為4.97/10μm、5.01/10μm、5.12/10μm,比未經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠相應(yīng)區(qū)域的樹突棘密度顯著增加,其中蘑菇型樹突棘所占的比例也分別增加37.0%、38.6%、43.0%。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠相比,經(jīng)過空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠海馬DAPK1水平降低81.4%、ERK增加36.2%、p-ERK增加42.4%、RSK1增加63.6%、p380-RSK增加73.8%、Caspase3降低126.7%、Caspase3剪切片段降低236.3%、Beclin1降低91.6%、LC3Ⅱ降低92.4%。 以上結(jié)果說明空間學(xué)習(xí)能顯著改善抑郁大鼠的抑郁行為；降低DAPK1的激活、提高ERK和RSKl活性是其中的關(guān)鍵機(jī)制。 結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著減低、海馬神經(jīng)元及樹突棘數(shù)量減少；應(yīng)激后皮質(zhì)酮水平升高、DAPK1激活并誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞增加可能是其中的關(guān)鍵機(jī)制之一：空間學(xué)習(xí)改善抑郁大鼠的抑郁程度,可能與空間學(xué)習(xí)抑制DAPK1激活、增強(qiáng)海馬ERK和RSK1活性密切相關(guān)。以上研究證明了海馬在抑郁病理進(jìn)程中的關(guān)鍵作用。DAPK1激活是否激活自噬、自噬在抑郁發(fā)病中的作用等問題有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：抑郁 海馬 糖皮質(zhì)激素 糖皮質(zhì)激素受體 凋亡 自噬 死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1) 胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK) 核糖體S6激酶1(RSK1) 空間學(xué)習(xí)記憶
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.4
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• Abstract11-17
• 第一部分 慢性應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為及學(xué)習(xí)記憶障礙17-54
• 前言17-19
• 材料和方法19-30
• 結(jié)果30-44
• 討論44-46
• 小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 第二部分 慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和自噬增加及機(jī)制54-85
• 前言54-57
• 材料和方法57-62
• 結(jié)果62-74
• 討論74-77
• 小結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 第三部分 空間學(xué)習(xí)改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠的抑郁樣行為85-99
• 前言85-86
• 材料和方法86-87
• 結(jié)果87-93
• 討論93-95
• 小結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-99
• 創(chuàng)新點(diǎn)99
• 下一步研究計(jì)劃99-100
• 綜述 抑郁癥與海馬及認(rèn)知功能障礙100-133
• 參考文獻(xiàn)113-133
• 博士期間參與的其他研究133-141
• 附錄一 博士期間發(fā)表的文章141-142
• 附錄二 博士期間獲得的主要獎(jiǎng)勵(lì)142
• 附錄三 博士期間參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議情況142-143
• 附錄四 中英文~.略詞對照表143-145
• 致謝145-146

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2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號(hào)：750633