發(fā)布時(shí)間：2017-08-22 21:37

  本文關(guān)鍵詞：染料木素通過(guò)JNK調(diào)控Fas和Bcl-2家族抑制Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 染料木素 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 JNK Fas Bcl-2

【摘要】：染料木素(genistein,Gen)是大豆異黃酮的主要活性成份。Gen作為植物雌激素,與雌激素相比,在發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)沒(méi)有對(duì)非神經(jīng)細(xì)胞的致癌等副作用。Gen的神經(jīng)保護(hù)作用受到持續(xù)關(guān)注。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),Gen可增強(qiáng)PKC的活性,調(diào)節(jié)α-/β-分泌酶活性,減少不溶性Aβ沉積,并逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào),降低細(xì)胞的凋亡程度,最終顯著提高Aβ刺激的PC12細(xì)胞的活力。目前,有關(guān)Gen的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制逐漸深入,但其分子保護(hù)機(jī)制及其相關(guān)的信號(hào)仍有待進(jìn)一步闡明。本論文繼續(xù)探討Gen體外水平的抗Aβ神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及其分子機(jī)制。具體內(nèi)容如下:1.Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力、凋亡染色、凋亡率的研究:MTT細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果顯示,0-25μM的Gen對(duì)細(xì)胞活力幾無(wú)影響,而50和100μM Gen使細(xì)胞存活率顯著降低,Aβ顯著降低PC12細(xì)胞存活率的最小劑量是20μM,0-100μM的Gen都顯著提高Aβ處理的PC12細(xì)胞存活率,而25μM的Gen具有最大保護(hù)效應(yīng);Hoechst 33342凋亡染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞有明顯的凋亡細(xì)胞特征,其凋亡細(xì)胞比例顯著多于對(duì)照組,而Gen處理組(12.5、25、50和100μM)顯著減少凋亡細(xì)胞的比例;Annexin V-FITC雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,Aβ組顯著高于對(duì)照組,且Gen作用組(12.5、25、50和100μM)都顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但25μM劑量的Gen具有最大抑制效應(yīng)。2.q PCR和Western blot檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表達(dá)的影響:q PCR結(jié)果顯示,Aβ誘導(dǎo)組顯著增加Fas L的表達(dá),溫和上調(diào)Fas的表達(dá),Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的Fas和Fas L m RNA的增加;Westernblot結(jié)果顯示,Aβ組顯著增加Fas和Fas L的表達(dá),Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的Fas和Fas L蛋白水平的增加。3.q PCR和Western blot檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表達(dá)的影響:q PCR結(jié)果顯示,Aβ組顯著減少Bcl-w和增加Bim的表達(dá),Gen可逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的Bcl-w和Bim的變化;Western blot結(jié)果與q PCR結(jié)果一致。4.Western blot檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞質(zhì)中Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的影響:結(jié)果顯示,Gen可逆轉(zhuǎn)Aβ刺激引起Cyt C和Smac從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的釋放。5.q PCR和分光光度法檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影響:結(jié)果顯示,Gen可抑制Aβ誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-8 m RNA的增加;Caspase-3和Caspase-8酶活性測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)了Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8的抑制作用。6.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK,檢測(cè)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表達(dá)的變化:結(jié)果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均對(duì)Aβ刺激引起的Fas和Fas L m RNA和蛋白水平表達(dá)有抑制作用,Gen與JNK-si RNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。7.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK,檢測(cè)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表達(dá)的變化:結(jié)果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均對(duì)Aβ刺激引起的Bcl-w和Bim m RNA和蛋白水平表達(dá)有抑制作用,Gen與JNK-si RNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。8.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK,檢測(cè)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞質(zhì)中Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的變化:結(jié)果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均對(duì)Aβ刺激引起的Cyt C和Smac蛋白表達(dá)有抑制作用,Gen與JNK-si RNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。9.采用JNK-si RNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK,檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力的影響:結(jié)果表明,Gen、JNK-si RNA和SP600125均對(duì)Aβ刺激引起的Caspase-3和Caspase-8 m RNA和酶活力有抑制作用,Gen與JNK-si RNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。10.Westernblot檢測(cè)Gen對(duì)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞p-JNK和JNK蛋白表達(dá)的影響:結(jié)果表明,Aβ顯著誘導(dǎo)PC12細(xì)胞p-JNK 54和46 k Da條帶,而Gen可顯著減弱p-JNK 54和46 k Da條帶,Gen+SP600125合用效果最強(qiáng)。研究結(jié)果表明,JNK-si RNA和SP600125均對(duì)Aβ刺激引起Fas介導(dǎo)凋亡途徑和線粒體凋亡途徑有抑制作用,暗示JNK參與調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas介導(dǎo)的和線粒體起始的凋亡途徑,而Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的JNK磷酸化的結(jié)果表明,Gen可能通過(guò)對(duì)Aβ誘導(dǎo)的JNK依賴的Fas和線粒體凋亡通路的抑制,從而抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而,Gen與JNK-si RNA或JNK抑制劑SP600125合用組的結(jié)果表明,Gen針對(duì)Aβ誘導(dǎo)的Fas和線粒體凋亡通路的抗凋亡效應(yīng)可能只是Gen多靶點(diǎn)抗凋亡效應(yīng)的其中之一,其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步被闡明。
【關(guān)鍵詞】：染料木素 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 JNK Fas Bcl-2
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 前言12-20
• 一、AD及研究策略概況12-16
• 1 AD以及分子病理機(jī)制概述12-14
• 1.1 中樞膽堿能損傷12
• 1.2 微管相關(guān)蛋白-Tau蛋白異常學(xué)說(shuō)12-13
• 1.3 Aa級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)13
• 1.4 基因突變或多型性學(xué)說(shuō)13-14
• 1.5 免疫功能突變14
• 1.6 興奮性氨基酸毒性學(xué)說(shuō)14
• 2 針對(duì)AD的研究策略14-16
• 2.1 藥物治療15
• 2.2 中醫(yī)中藥15
• 2.3 神經(jīng)干細(xì)胞移植治療15
• 2.4 基因治療15
• 2.5 其它干預(yù)治療15-16
• 二、凋亡與AD16
• 1 Aa與神經(jīng)細(xì)胞凋亡16
• 2 PS突變與神經(jīng)細(xì)胞凋亡16
• 3 Ca_(2+)失衡與神經(jīng)細(xì)胞凋亡16
• 三、GEN神經(jīng)保護(hù)作用研究概況16-18
• 1 直接與Aβ 結(jié)合17
• 2 抗氧化作用17
• 3 抑制Ca_(2+)超載及興奮性毒性損傷17-18
• 4 抑制炎癥反應(yīng)18
• 5 激活受體18
• 四、本研究的目的和意義18-20
• 第一部分 染料木素抑制AΒ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的研究20-29
• 一、材料與方法20-24
• 1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 1.1 主要試劑20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞20
• 1.3 主要儀器20-21
• 1.4 主要試劑配制21-22
• 2 實(shí)驗(yàn)方法22-24
• 2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力23
• 2.3 Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化23
• 2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率23
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理23-24
• 二、結(jié)果24-27
• 1 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力影響24-25
• 2 Hoechst 33342染色觀察Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的形態(tài)影響25-26
• 3 Annexin V-FITC流式細(xì)胞儀檢測(cè)Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率的影響26-27
• 三、討論27-29
• 第二部分 染料木素抑制AΒ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的研究29-49
• 一、材料與方法30-43
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-33
• 1.1 主要試劑30-31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞31
• 1.3 主要儀器31-32
• 1.4 主要試劑配制32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-43
• 2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)33
• 2.2 RT-q PCR分析33-37
• 2.3 免疫印跡分析37-41
• 2.4 Caspase-3 和Caspase-8 酶活力檢測(cè)41-43
• 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理43
• 二、結(jié)果43-46
• 1 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas和Fas L m RNA和蛋白表達(dá)的影響43-44
• 2 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和Bim m RNA和蛋白表達(dá)的影響44-45
• 3 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的影響45-46
• 4 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3 和Caspase-8 m RNA和酶活力的影響46
• 三、討論46-49
• 第三部分 JNK信號(hào)在染料木素對(duì)AΒ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡抑制的作用研究49-57
• 一、材料與方法50-51
• 1 實(shí)驗(yàn)材料50
• 1.1 主要試劑50
• 1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞50
• 1.3 主要儀器50
• 1.4 主要試劑配制50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50-51
• 2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)50
• 2.2 RNA干擾50-51
• 2.3 RT-q PCR分析51
• 2.4 免疫印跡分析51
• 2.5 Caspase-3 和Caspase-8 酶活力檢測(cè)51
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理51
• 二、結(jié)果51-55
• 1 JNK-si RNA和SP600125對(duì)Gen調(diào)節(jié)的Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas和Fas Lm RNA和蛋白表達(dá)的影響51-52
• 2 JNK-si RNA和SP600125對(duì)Gen調(diào)節(jié)的Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和Bimm RNA和蛋白表達(dá)的影響52-53
• 3 JNK-si RNA和SP600125對(duì)Gen調(diào)節(jié)的Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的影響53-54
• 4 JNK-si RNA和SP600125對(duì)Gen調(diào)節(jié)的Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3 和Caspase-8 m RNA表達(dá)和酶活力的影響54-55
• 5 Gen對(duì)Aβ 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞JNK磷酸化水平的影響55
• 三、討論55-57
• 總結(jié)57-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 主要英文縮寫詞表68-70
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文70-71
• 致謝71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

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本文編號(hào)：721102