本文關(guān)鍵詞：熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜檢測Aβ寡聚體與kinesin-1蛋白相互作用

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD),又稱老年性癡呆,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其主要病理特征為細胞外老年斑(senile plaques, SPs)和細胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)。雖然AD的確切病因和發(fā)病機制仍未清楚,但β淀粉樣蛋白假說(amyloid-β,Aβ)是目前公認的主流學說。Aβ過產(chǎn)和/或Aβ清除障礙造成的細胞外SPs可能是其主要致病因素,其中,可溶性Aβ寡聚體相對于單體和纖維狀Aβ則具有更強的毒性作用,特別是Aβ42寡聚體,可能是主要的致病因子。研究發(fā)現(xiàn)在AD患者和動物模型中存在著軸突運輸功能紊亂現(xiàn)象,且有證據(jù)顯示驅(qū)動蛋白kinesin在其中扮演著重要的角色,因此,研究Aβ寡聚體與kinesin間相互作用將有助于揭示AD的發(fā)病機制,為AD的診斷與防治提供更多的理論與實驗依據(jù)。 雙色熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜(dual color-fluorescence cross correlation spectroscopy, DC-FCCS)是一種通過測量溶液中微小尺度內(nèi)熒光強度隨時間的漲落而進行分析的單分子熒光檢測技術(shù),可檢測兩種熒光組分的信號,尤其適于生物大分子間相互作用的研究。雖然β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)與kinesin蛋白的直接相互作用已有體內(nèi)和體外實驗證明,但Aβ寡聚體與kinesin的直接相互作用研究還未見報道,尤其是在單分子水平上對二者相互作用的直接觀察,因此,我們通過擴增了kinesin-1輕鏈蛋白(kinesin light chain, KLC)的編碼序列,構(gòu)建質(zhì)粒、表達并純化了KLC-EGFP-His(以下簡寫KLC-E)和EGFP-KLC-His(以下簡寫E-KLC)兩種融合蛋白,建立了DC-FCCS觀察Aβ寡聚體與KLC融合蛋白間相互作用的的檢測方法,并探討了反應計量關(guān)系和EGFP標簽位置對二者作用的影響。 本課題選用Bac-To-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)進行目的蛋白的真核表達,首先擴增KLC和EGFP編碼序列,然后分別將兩個片段按不同順序連接到pFastBacl載體上,并在各自C端連接His標簽編碼序列；獲得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH10Bac感受態(tài)中,包裝重組桿狀病毒DNA分子并轉(zhuǎn)染Sf9細胞；包裝并擴增出強感染力重組桿狀病毒,分別感染Sf9細胞過表達KLC-E和E-KLC融合蛋白,并進行蛋白純化；Atto647N NHS ester熒光染料標記Aβ42單體并制備寡聚體；Aβ42寡聚體與目的蛋白孵育并進行DC-FCCS檢測。實驗結(jié)果顯示,在0-4h內(nèi),Aβ42寡聚體與KLC-E和E-KLC間結(jié)合效率均逐漸增強；并且隨著時間推移,高、低計量反應的KLC-E和E-KLC均會促進Aβ42寡聚體的進一步聚集,但在低計量反應下,E-KLC對Aβ42寡聚化促進程度稍大于KLC-E;高計量反應的KLC-E和E-KLC相較于低計量反應,與Aβ42寡聚體的結(jié)合效率更高,但無論高、低計量反應,E-KLC與Aβ42寡聚體的結(jié)合效率顯著大于KLC-E與Aβ42寡聚體結(jié)合效率。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 Aβ42寡聚體 驅(qū)動蛋白 雙色熒光交叉關(guān)聯(lián)光譜
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-19
• 1.1 研究背景和意義12-13
• 1.2 Ap寡聚體形成及其毒性作用13-14
• 1.3 kinesin蛋白及其在AD病理性研究中進展14-15
• 1.4 熒光關(guān)聯(lián)光譜技術(shù)及其在AD研究中的應用15-17
• 1.5 實驗設(shè)計與流程17-19
• 2 實驗材料19-24
• 2.1 細胞、載體與宿主菌19
• 2.2 工具酶與試劑盒19
• 2.3 主要生化試劑19-20
• 2.4 主要實驗儀器20
• 2.5 主要溶液配制20-24
• 3 實驗方法24-38
• 3.1 細胞培養(yǎng)24-25
• 3.2 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定25-34
• 3.2.1 目的基因獲得25-29
• 3.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建29-31
• 3.2.3 轉(zhuǎn)座31
• 3.2.4 重組桿狀病毒基因組DNA(rBacmid DNA)的提取31
• 3.2.5 rBacmid DNA的PCR鑒定31-32
• 3.2.6 重組桿狀病毒的獲得32-33
• 3.2.7 Western blot鑒定目的蛋白表達33-34
• 3.3 目的蛋白純化34-35
• 3.4 Aβ42單體標記及寡聚體制備35
• 3.5 DC-FCCS檢測Aβ42寡聚體與KLC間相互作用35-38
• 3.5.1 儀器及參數(shù)35-37
• 3.5.2 激發(fā)體積的校正37-38
• 4 實驗結(jié)果38-48
• 4.1 細胞培養(yǎng)38
• 4.2 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定38-42
• 4.2.1 目的基因和載體獲得38-40
• 4.2.2 攜帶KLC-E、E-KLC的桿狀病毒表達載體的構(gòu)建40-41
• 4.2.3 表達KLC-E、E-KLC蛋白的重組桿狀病毒的獲得41-42
• 4.3 Western blot鑒定目的蛋白表達42-43
• 4.4 目的蛋白純化43-45
• 4.5 DC-FCCS檢測Aβ42寡聚體與KLC相互作用45-48
• 4.5.1 Aβ42寡聚體與KLC相互作用的動力學過程45-46
• 4.5.2 KLC計量效應對Aβ42寡聚體尺寸的影響46-47
• 4.5.3 EGFP標簽對Aβ42寡聚體與KLC結(jié)合效率的影響47-48
• 5 討論48-51
• 6 結(jié)論51-52
• 參考文獻52-57
• 附錄A57-59
• 作者簡歷及攻讀碩士學位期間取得的研究成果59-61
• 學位論文數(shù)據(jù)集61

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本文編號：688622