本文關(guān)鍵詞：錯(cuò)誤折疊的超氧化物歧化酶-1導(dǎo)致淀粉樣蛋白β聚積增加

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【摘要】：淀粉樣斑塊是阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD)的主要病理特征之一，這種斑塊的主要成分是淀粉樣蛋白β(amyloid β, Aβ)。研究已證明，Aβ蛋白寡聚體有多種毒性，可破壞神經(jīng)突觸，被認(rèn)為是AD的重要發(fā)病機(jī)制。一些家族遺傳型的AD患者腦組織內(nèi)Aβ較多，也說(shuō)明Aβ與AD的密切關(guān)系。Aβ可自發(fā)聚積，Aβ淀粉樣斑塊的分子構(gòu)象已較為明確，即多個(gè)蛋白單體中的β折疊整齊地如積木搬堆疊在一起，形成一個(gè)長(zhǎng)軸與β折疊垂直的條帶，這個(gè)條帶被稱為Aβ蛋白原纖維。多條蛋白原纖維再相互纏繞堆積，最終導(dǎo)致淀粉樣斑塊的生成。蛋白原纖維形成需要一個(gè)相對(duì)耗時(shí)的“成核”階段，即最初的幾個(gè)Aβ聚積成一個(gè)穩(wěn)定的原纖維核的過(guò)程。一旦“成核”完成，，Aβ就可以較為快速的添加到已有的蛋白原纖維上。顯然更多的核會(huì)讓Aβ的聚積更容易。 另一方面，老化是AD最重要的危險(xiǎn)因素，但機(jī)制不明確�，F(xiàn)在普遍認(rèn)為體內(nèi)和體外環(huán)境中大量存在的活性氧簇攻擊細(xì)胞后留下的損傷積累起來(lái)導(dǎo)致了老化現(xiàn)象，過(guò)氧化物歧化酶-1(Superoxide dismutase-1，SOD1)的正常功能是歧化過(guò)氧化物，減少活性氧簇的攻擊，但其本身作為一種需要與大量活性氧簇接觸的蛋白質(zhì)很容易被氧化。氧化型和突變型SOD1仍然具有歧化過(guò)氧化物的功能，但很容易錯(cuò)誤折疊，并形成聚積，這種聚積有著與Aβ聚積相似的β折疊堆疊結(jié)構(gòu)。已有研究顯示，Aβ蛋白與SOD1可堆積在一起并產(chǎn)生蛋白間相互作用。 基于上述研究發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)，SOD1可能是Aβ與老化之間關(guān)系的關(guān)鍵分子，即：因氧化修飾或基因突變而形成錯(cuò)誤折疊的SOD1，獲得特殊的性質(zhì)而使Aβ寡聚物和纖維增多，從而使Aβ增加和老年斑形成。我們假設(shè)這種特殊的性質(zhì)可能是因?yàn)槭荢OD1錯(cuò)誤折疊形成的聚積和Aβ蛋白有著相似的β折疊結(jié)構(gòu)，所以Aβ蛋白可以疊加在SOD1核上，形成以SOD1為核的Aβ原纖維，使得Aβ的聚積增加。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和基因型檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)中使用了同時(shí)具有SOD1/G37R突變和APP瑞典突變的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠。這種小鼠是通過(guò)兩種具有單一突變的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交而來(lái)。雙轉(zhuǎn)小鼠的篩選主要包括DNA提取、PCR和凝膠電泳三個(gè)步驟。 2.小鼠腦標(biāo)本收集及切片制備：當(dāng)幼鼠達(dá)到預(yù)定月齡時(shí)即被處死并進(jìn)行標(biāo)本收集和制備，小鼠的左腦用于制備切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究而右腦則用于蛋白定量實(shí)驗(yàn)。 3.腦片的剛果紅(Congo red)染色：本實(shí)驗(yàn)中的剛果紅染色使用了Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)的剛果紅染色試劑盒。 4. N2a/APPsw細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 5.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增和提取: pcDNA3.1-G37R鏈接產(chǎn)物由陳雪萍(Departmentof Human Anatomy and Cell Science University of Manitoba, Winnipeg, Canada)提供。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟按Invitrogen公司MAX Efficiency DH5α Competent Cells試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行。 6.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：為了研究突變型SOD1對(duì)于Aβ蛋白聚積的影響，我們用G37R突變的SOD1基因轉(zhuǎn)染了N2a/APPsw細(xì)胞。本研究中使用了Lipofectamin2000(Invitrogen)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。 7. Aβ和SOD1雙重免疫熒光染色 8.腦皮質(zhì)Aβ42/40蛋白酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 9.統(tǒng)計(jì)分析： ELISA結(jié)果中的濃度值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)結(jié)果方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行方差分析。小鼠大腦淀粉樣斑塊負(fù)荷(Amyloid burden)為淀粉樣斑塊面積占視野中整個(gè)大腦面積百分比，淀粉樣斑塊數(shù)量以及淀粉樣斑塊負(fù)荷結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析。小鼠腦片免疫熒光染色結(jié)果中的細(xì)胞內(nèi)淀粉樣斑塊負(fù)荷(intracellular amyloid plaqueburden)為視野下胞質(zhì)中呈斑塊樣的信號(hào)面積占視野下整體細(xì)胞面積的百分比，平均熒光強(qiáng)度為細(xì)胞質(zhì)熒光密度與細(xì)胞質(zhì)面積的比值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析。P值0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.雙轉(zhuǎn)小鼠腦皮質(zhì)中可溶性及不可溶性Aβ42/40含量上升 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雙轉(zhuǎn)小鼠腦中Aβ42和Aβ40的增長(zhǎng)呈現(xiàn)類似的特征。對(duì)于可溶性Aβ42和Aβ40,9月齡和12月齡年齡組小鼠存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組內(nèi)差異，雙轉(zhuǎn)小鼠腦皮質(zhì)中的可溶性Aβ42和Aβ40顯著高于單轉(zhuǎn)小鼠組，說(shuō)明突變的SOD1使這兩個(gè)月齡組小鼠腦皮質(zhì)中的可溶性Aβ42和Aβ40增加。3月齡和6月齡組中并未檢測(cè)出兩種基因型小鼠間有Aβ42和Aβ40的明顯差異。說(shuō)明可溶性的Aβ42和Aβ40的主要增長(zhǎng)時(shí)間在6月齡之后。 對(duì)于不可溶性Aβ42和Aβ40，6月、9月及12月齡組均存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組內(nèi)差異，說(shuō)明突變的SOD1使小鼠腦皮質(zhì)中的不可溶性Aβ42和Aβ40含量均有增加。并且相對(duì)于可溶性的Aβ42和Aβ40,不可溶性Aβ42和Aβ40受突變SOD1影響的時(shí)間更早，從6月齡開始就有了顯著的差異。 2.雙轉(zhuǎn)小鼠腦中淀粉樣斑塊生成沒有明顯增多和提前 染色結(jié)果顯示兩組小鼠淀粉樣斑塊的數(shù)量以及大小之間的差異并不明顯。在12月齡時(shí)兩組小鼠腦中或只發(fā)現(xiàn)了微小的散在的斑塊或者完全沒有斑塊形成，在8月齡雙轉(zhuǎn)小鼠腦中也并未發(fā)現(xiàn)任何淀粉樣斑塊。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組小鼠大腦淀粉樣斑塊負(fù)荷(Amyloid burden)以及斑塊數(shù)量沒有差別。該結(jié)果提示雙轉(zhuǎn)小鼠腦中的淀粉樣斑塊生成并沒有明顯的增多或者提前。 3. APP+/G37R+12月齡雙轉(zhuǎn)小鼠神經(jīng)元中Aβ蛋白聚積增加 結(jié)果顯示APP+/G37R+12月齡小鼠神經(jīng)元中Aβ蛋白信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于單轉(zhuǎn)小鼠腦中的Aβ信號(hào)強(qiáng)度。且雙轉(zhuǎn)小鼠中神經(jīng)元中Aβ蛋白除一部分在細(xì)胞質(zhì)中聚積成斑塊狀，還有一部分蛋白在細(xì)胞質(zhì)中彌散分布。細(xì)胞內(nèi)淀粉樣斑塊負(fù)荷(intracellular amyloidplaque burden)統(tǒng)計(jì)提示雙轉(zhuǎn)小鼠細(xì)胞內(nèi)聚積成斑塊狀的Aβ占整個(gè)細(xì)胞面積的百分比約為單轉(zhuǎn)小鼠該比值的8倍。而雙轉(zhuǎn)小鼠細(xì)胞質(zhì)的平均熒光強(qiáng)度值也強(qiáng)于單轉(zhuǎn)小鼠，說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)中可溶性的Aβ蛋白也增加了。該結(jié)果提示在雙轉(zhuǎn)小鼠模型中，突變的SOD1使Aβ的表達(dá)增加，并且Aβ的聚積也有所增加。這個(gè)結(jié)果與Aβ的ELISA結(jié)果相符，彌散和聚積的Aβ蛋白分別對(duì)應(yīng)不可溶和可溶性的Aβ。并且聚積的Aβ與聚積的SOD1在細(xì)胞中共定位，提示了這兩者間緊密的聯(lián)系。 4. Aβ蛋白在N2a/APPsw/G37R細(xì)胞中表達(dá)和聚積增加 成功轉(zhuǎn)染了SOD1基因的細(xì)胞因?yàn)楸磉_(dá)人類突變的SOD1而被SOD1探針識(shí)別，發(fā)出綠色熒光。突變的SOD1在細(xì)胞質(zhì)中彌散分布，也有小部分聚積成顆粒狀，但并不明顯，可是能由于染色時(shí)間僅為轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，突變的SOD1還未形成較大體積的聚積。成功轉(zhuǎn)染SOD1基因的N2a細(xì)胞中的Aβ蛋白信號(hào)強(qiáng)于未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并且一部分蛋白聚積成了較大的顆粒。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ELISA和小鼠腦皮質(zhì)冰凍切片的雙重免疫熒光標(biāo)記結(jié)果相符，都說(shuō)明突變的SOD1蛋白能夠使細(xì)胞表達(dá)更多的Aβ蛋白并且Aβ蛋白的聚積也會(huì)增加。另外，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明突變的SOD1蛋白在還沒有形成較大的聚積時(shí)就可以增加Aβ蛋白的表達(dá)與聚積。與腦皮質(zhì)標(biāo)本不同的是SOD1蛋白和Aβ蛋白在N2a/APPsw/G37R細(xì)胞中并未形成明顯的共定位，可能與較短的轉(zhuǎn)染后時(shí)間有關(guān)。 討論和結(jié)論 本試驗(yàn)研究了Aβ聚積的具體形式以及錯(cuò)誤折疊的SOD1在體內(nèi)以及體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)Aβ聚積的影響。我們用ELISA的方法觀察了轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)中可溶性和不可溶性的Aβ蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了錯(cuò)誤折疊的SOD1增加了Aβ蛋白的聚積，雙轉(zhuǎn)小鼠腦中可溶性與不可溶性的Aβ含量均上升，與我們的預(yù)期結(jié)果并不完全相符。我們的猜想是錯(cuò)誤折疊的SOD1通過(guò)成為額外的“核”來(lái)增加Aβ的聚積，而不是增加Aβ的整體含量。這說(shuō)明Aβ的整體表達(dá)量在雙轉(zhuǎn)小鼠中增加，錯(cuò)誤折疊的SOD1可能是通過(guò)別的方式影響了Aβ的聚積，比如SOD1錯(cuò)誤折疊后獲得的毒性作用。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中提示雙轉(zhuǎn)動(dòng)物腦中不可溶性Aβ的升高的時(shí)間早于可溶性Aβ的升高的時(shí)間，也提示了負(fù)反饋調(diào)節(jié)存在的可能性。Bradley J. Turner等人之前的研究結(jié)果顯示APP蛋白和Aβ蛋白在G93A轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)中的含量較野生型小鼠沒有明顯增加，這與本實(shí)驗(yàn)中的結(jié)論相悖。 剛果紅對(duì)小鼠腦片進(jìn)行染色顯示，雙轉(zhuǎn)和單轉(zhuǎn)小鼠腦中淀粉樣斑塊的情況并沒有明顯的差異，都僅有少量或沒有斑塊，這與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不符。我們分析可能是因?yàn)镚37R突變相對(duì)來(lái)說(shuō)是一種較為溫和的突變，所以對(duì)于APP+/G37R+小鼠來(lái)說(shuō)，12月齡可能仍然是淀粉樣斑塊剛開始形成的時(shí)期，這導(dǎo)致了這一時(shí)期雙單轉(zhuǎn)小鼠之間的差異尚不明顯。 雙重免疫熒光染色來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)SOD1與Aβ的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，雙轉(zhuǎn)小鼠神經(jīng)元中的Aβ整體含量以及Aβ聚積形成的斑塊的數(shù)量和面積都明顯高于單轉(zhuǎn)小鼠。而細(xì)胞質(zhì)中彌散的Aβ含量也在雙轉(zhuǎn)小鼠中升高了。在細(xì)胞中彌散和聚積分布的Aβ分別對(duì)應(yīng)了可溶性Aβ42和不可溶性Aβ42的ELISA結(jié)果。雙轉(zhuǎn)小鼠細(xì)胞中這兩類的Aβ信號(hào)都得到了增強(qiáng)，這個(gè)結(jié)果與ELISA的結(jié)果相一致。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及其他實(shí)驗(yàn)小組對(duì)于Aβ在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外聚積的觀察，我們推測(cè)Aβ增高后首先會(huì)在細(xì)胞內(nèi)聚積，聚積的程度可能需要達(dá)到某一個(gè)閾值才會(huì)開始由細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。 我們利用與動(dòng)物模型相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞模型并且觀測(cè)到了相似的結(jié)果。值得指出的是在N2a細(xì)胞中的的SOD1并沒有像在動(dòng)物神經(jīng)元中那樣聚積成斑塊并且和Aβ斑塊共定位，這提示誤折疊的SOD1不需要聚積成較大的“核”就可以增加Aβ的表達(dá)和聚積，再一次提示除了“成核”之外，錯(cuò)誤折疊的Aβ可能還通過(guò)其他方式使Aβ表達(dá)上升。 綜上所述，本研究結(jié)果顯示，錯(cuò)誤折疊的SOD1在體外、細(xì)胞、和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平都使Aβ的聚積增多，提示SOD1的錯(cuò)誤折疊可能是Aβ聚積和AD起病的初始原因之一。
【關(guān)鍵詞】：淀粉樣蛋白β(Aβ) 超氧化物歧化酶-1(SOD1) 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊 蛋白質(zhì)聚積 阿爾茲海默病
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 主要英文縮寫一覽表4-5
• Abstract5-10
• 中文摘要10-15
• 1. 前言15-18
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料和方法18-28
• 3. 結(jié)果28-36
• 4. 討論36-40
• 全文總結(jié)40-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 文獻(xiàn)綜述43-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：675142