本文關(guān)鍵詞：迷迭香酸對CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用及其機制研究

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【摘要】：研究目的:本研究的主要目的是應用慢性不可預見應激(chronic unpredictable stress,CUS)的大鼠模型進行研究,探討迷迭香酸(Rosmarinic acid,RA)對CUS大鼠抑郁樣行為的改善作用以及對大鼠海馬區(qū)域細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-regulated kinase,ERK)信號傳遞的改變,海馬的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)水平的調(diào)節(jié)是否是RA改善CUS模型大鼠抑郁樣行為的基礎(chǔ)。此外,本研究還通過離體研究觀察了RA對海馬星形膠質(zhì)細胞活力、增殖的作用以及對其ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達的影響,以進一步探討RA發(fā)揮抗抑郁作用的細胞學基礎(chǔ)。研究方法:1、觀察RA干預對CUS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及海馬ERK1/2磷酸化水平和BDNF、GDNF表達的影響。雄性Sprague Dawley(SD)大鼠被隨機分為6組,每組16只:(1)對照組(sham+vehicle),實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周;(2)對照+RA低劑量組(sham+RA(L)),實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后,每天腹腔注射RA(5mg/Kg體重),連續(xù)2周;(3)對照+RA高劑量組(sham+RA(H)),實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后,每天腹腔注射RA(10 mg/Kg體重),連續(xù)2周;(4)模型組(CUS+vehicle),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周;(5)模型+ra低劑量組(cus+ra(l)),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射ra(5mg/kg體重),連續(xù)2周;(6)模型+ra高劑量組(cus+ra(h)),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射ra(10mg/kg體重),連續(xù)2周。ra干預結(jié)束后,對實驗設(shè)計中的部分大鼠(每組8只,共計48只)進行強迫游泳實驗和曠場實驗、測試后,提取大鼠的海馬組織蛋白樣品,分別檢測bdnf、gdnf、erk1/2、perk1/2的水平。其余8只大鼠進行水迷宮實驗。2、應用erk磷酸化抑制劑u0126干預后,觀察ra干預對cus抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及海馬erk1/2磷酸化水平和bdnf表達的作用。結(jié)合第一部分實驗的結(jié)果,實驗二仍然分為6組,每組16只:(1)對照組(sham+vehicle),實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射對照溶劑(0.6ml/kg體重);(2)對照+u0126組(sham+u0126),實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)2周后,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射u0126(0.5mg/kg體重);(3)模型組(cus+vehicle),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射對照溶劑(0.6ml/kg體重);(4)模型組+u0126組(cus+u0126),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射生理鹽水,連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射u0126(0.5mg/kg體重);(5)模型+ra高劑量組(cus+ra(h)),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射ra(10mg/kg體重),連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射對照溶劑(0.6ml/kg體重);(6)模型+ra高劑量+u0126組(cus+ra(h)+u0126),大鼠接受為期3周的慢性不可預見應激,從第3周干預開始,每天腹腔注射ra(10mg/kg體重),連續(xù)2周,并且在注射生理鹽水前30min注射u0126(0.5mg/kg體重)。對照溶劑為二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,dmso)水溶液(dmso:生理鹽水=1:4)。與第一部分實驗指標相同,干預結(jié)束后對部分大鼠(每組8只)進行強迫游泳和曠場實驗測試后,取其海馬組織蛋白樣品,分別檢測bdnf、erk1/2、perk1/2的水平。其余大鼠進行水迷宮實驗。3、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細胞,觀察不同劑量ra對該細胞活力、erk1/2磷酸化水平和bdnf表達的影響。并在此基礎(chǔ)上添加u0126,觀察不同劑量ra對星形膠質(zhì)細胞erk1/2磷酸化水平和bdnf表達的影響。通過原代培養(yǎng)的方法獲得新生sd大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞,經(jīng)純度鑒定后,接種于96或6孔細胞培養(yǎng)板中,待貼壁牢固后,加入不同濃度的ra(ra經(jīng)dmem稀釋后,配置成10、50、100、200和400μg/ml的10×母液,在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達到終濃度,對照組加入相應體積的dmem),作用48h后,通過wst-1方法檢測細胞活力,通過brdu摻入實驗觀察ra對星形膠質(zhì)細胞增殖的作用,同時取細胞上清液檢測bdnf釋放的情況,并且提取蛋白,用westernblot方法檢測erk1/2,perk1/2的表達情況。另一部分星形膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)體系中加入u0126(終濃度2μm),接種方式和檢測指標同前。4、原代培養(yǎng)海馬星形膠質(zhì)細胞,觀察不同劑量ra對該細胞活力、增殖情況和gdnf表達的影響。海馬星形膠質(zhì)細胞經(jīng)純度鑒定后,接種于96或24孔細胞培養(yǎng)板中,待貼壁牢固后,加入不同濃度的ra(ra經(jīng)dmem稀釋后,配置成10、50、100、200和400μg/ml的10×母液,在原培養(yǎng)體系中加入培養(yǎng)液1/10的母液即可達到終濃度,對照組加入相應體積的dmem),作用48h或72h后,取細胞上清液檢測gdnf釋放的情況。并且在作用72h后,通過wst-1方法檢測細胞活力,通過brdu摻入實驗觀察ra對星形膠質(zhì)細胞增殖的作用。結(jié)果:實驗一部分顯示,大鼠經(jīng)cus處理后表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為并且海馬磷酸化erk1/2的表達和bdnf、gdnf的水平均下調(diào);而經(jīng)ra干預后,抑郁模型大鼠的抑郁樣行為得到改善并且海馬磷酸化erk1/2的表達和bdnf、gdnf的水平上調(diào)。具體如下:1.與對照處理相比,cus處理后大鼠:(1)在曠場實驗中,水平運動距離減少(p0.01);(2)強迫實驗中的大鼠不動時間延長(p0.01);(3)morris水迷宮實驗中,在目標象限停留時間縮短(p0.01);(4)westernblot檢測結(jié)果顯示,海馬erk1/2的表達沒有顯著影響,但是抑制了perk1/2的表達(p0.01);(5)elisa結(jié)果顯示,海馬bdnf、gdnf水平下降(均為p0.01)。2.與cus組相比,經(jīng)高劑量ra(10mg/kg體重)治療后的大鼠:(1)在曠場實驗中,水平運動距離增加(p0.05);(2)強迫游泳不動時間縮短(p0.05);(3)水迷宮實驗中,在目標象限停留時間延長(p0.05);(4)westernblot檢測結(jié)果顯示,海馬erk1/2的表達沒有顯著影響,但是perk1/2的表達上調(diào)(p0.05);(5)elisa結(jié)果顯示,海馬bdnf、gdnf水平上調(diào)(均p0.05)。實驗二部分,研究發(fā)現(xiàn)ra對抑郁動物行為的改善作用可以被u0126所阻斷,而且westernblot的結(jié)果也顯示u0126不僅抑制了ra對抑郁動物海馬erk1/2磷酸化的上調(diào)作用,而且抑制了其對bdnf的調(diào)節(jié)作用。具體如下:1.雙因素方差分析結(jié)果顯示,造模與否(shamvs.cus)在曠場實驗的水平運動距離(f=27.088,p=0.000),強迫游泳不動時間(f=15.924,p=0.000)以及水迷宮實驗中,在目標象限停留時間(f=28.233,p=0.000)均存在顯著性差異。此外,各干預因素(包括對照溶劑、u0126、ra以及ra+u0126)之間對動物行為學的作用也存在顯著性差異,包括曠場實驗的水平運動距離(f=3.247,p=0.031),強迫游泳不動時間(f=3.981,p=0.014)以及水迷宮實驗中,在目標象限停留時間(f=3.800,p=0.017);而且處理方式和干預這兩種處理對上述三項行為學指標的影響不存在交互作用。進一步多重比較發(fā)現(xiàn),ra高劑量組與ra高劑量+u0126在上述三項行為學檢測指標中均存在顯著性差異(p0.05)。2.實驗二也觀察了不同處理方式和干預因素對海馬perk1/2和bdnf的水平的影響。其中,造模與否之間perk1/2的表達(f=30.712,p0.001)和bndf的水平(f=18.920,p=0.001)存在顯著差異;不同干預方式之間perk1/2的表達(f=4.772,p=0.008)和bndf的水平(f=2.646,p=0.041)也存在顯著差異。造模與否與不同干預方式之間不存在交互作用。多重比較結(jié)果顯示,ra高劑量組與ra高劑量+u0126在perk1/2的表達和bndf的水平中均存在顯著性差異(p0.05)。實驗三部分,通過原代培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細胞,在細胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的ra作用48h,結(jié)果顯示:直接給予不同劑量ra對星形膠質(zhì)細胞細胞活力(f5,30=0.456,p=0.806)和增殖水平(f5,20=0.766,p=0.912)并沒有顯著作用;對erk1/2的表達也沒有顯著影響(f5,24=0.098,p=0.992),但是對perk1/2(f5,24=3.147,p=0.025)以及bdnf(f5,30=2.615,p=0.045)的表達卻存在顯著差異。多重比較結(jié)果顯示,在劑量為20μg/ml或40μg/ml時卻可以促進erk磷酸化水平,而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進BDNF的釋放。經(jīng)過U0126干預后,經(jīng)雙因素方差分析,星形膠質(zhì)細胞ERK1/2的表達沒有顯著變化(F=0.245,P=0.992),但是對pERK1/2(F=0.591,P0.001)以及BDNF(F=22.277,P0.001)的表達卻存在顯著影響。而且不同RA劑量+U0126組之間均沒有顯著性差異(P0.05)。實驗四部分,通過原代培養(yǎng)獲得星形膠質(zhì)細胞,在細胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的RA作用48 h或72 h,結(jié)果顯示:直接給予不同劑量RA作用72 h對星形膠質(zhì)細胞細胞活力(F5,30=0.351,P=0.0306)和增殖水平(F5,25=6.693,P0.01)均具有促進作用;對BDNF(F5,30=3.251,P=0.016)的水平也具有促進作用。多重比較結(jié)果顯示,在劑量為20μg/mL或40μg/mL時可以促進星形膠質(zhì)細胞增殖,而且在劑量為20μg/mL的情況下還可以促進其細胞活力和GDNF的釋放。結(jié)論:CUS模型大鼠表現(xiàn)明顯的抑郁樣行為,而一定劑量的RA干預能改善這一行為表現(xiàn),并且緩解由CUS所致海馬pERK1/2和BDNF、GDNF水平下降的情況,但是,應用ERK磷酸化抑制劑U0126可以阻斷上述效應;一定劑量的RA還可以促進海馬星形膠質(zhì)細胞ERK磷酸化和BDNF的表達,這一作用同樣可以被U0126阻斷;此外,一定劑量的RA在作用72 h后可以促進星形膠質(zhì)細胞增殖、上調(diào)細胞活力以及GDNF的釋放。以上結(jié)果表明,RA可能是通過上調(diào)抑郁大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的ERK1/2磷酸化,促進其釋放BDNF、GDNF,進而發(fā)揮抗抑郁效應的。
【關(guān)鍵詞】：迷迭香酸 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 膠質(zhì)源性細胞因子 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 海馬 抑郁癥
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-20
• 文獻回顧20-49
• 1 抑郁癥概況20-22
• 2 抑郁癥的發(fā)病機制研究22-30
• 3 抑郁癥的治療30-40
• 4 星形膠質(zhì)細胞在抑郁癥的發(fā)病和治療中的作用40-49
• 實驗一：迷迭香酸對CUS大鼠抑郁樣行為的作用及海馬ERK磷酸化和BDNF、GDNF表達的影響49-67
• 1 材料49-51
• 2 方法51-56
• 3 結(jié)果56-62
• 4 討論62-67
• 實驗二：ERK信號通路在迷迭香酸發(fā)揮抗抑郁效應中的作用67-76
• 1 材料67
• 2 方法67-69
• 3 結(jié)果69-74
• 4 討論74-76
• 實驗三：迷迭香酸對海馬星形膠質(zhì)細胞BDNF表達的影響及其機制76-83
• 1 材料76-77
• 2 方法77-79
• 3 結(jié)果79-81
• 4 討論81-83
• 實驗四：迷迭香酸對海馬星形膠質(zhì)細胞增殖的作用及其GDNF表達的影響83-88
• 1 材料83
• 2 方法83-84
• 3 結(jié)果84-85
• 4 討論85-88
• 小結(jié)88-90
• 參考文獻90-112
• 個人簡歷和研究成果112-114
• 致謝114

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本文編號：671578