本文關(guān)鍵詞：鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化上調(diào)β淀粉樣蛋白的生成

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【摘要】：唐氏綜合癥(Down syndrome, DS)是最常見(jiàn)的人類遺傳性疾病之一,以先天性認(rèn)知功能缺陷,癡呆,學(xué)習(xí)記憶能力低下以及先天性心臟病,白血病高風(fēng)險(xiǎn)為主要臨床表現(xiàn)。隨著年齡的增長(zhǎng),罹患DS的病人大腦中都不可避免地檢測(cè)到類似于阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的神經(jīng)病理特征,包括神經(jīng)毒性斑塊,神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元死亡。因此,通過(guò)研究DS的分子病理基礎(chǔ)以探尋AD的發(fā)病機(jī)制是很有意義的。DS的遺傳學(xué)病因主要是攜帶了三倍體的21號(hào)染色體的全長(zhǎng)或部分,位于21號(hào)染色體的21q22.1～21q22.3區(qū)域被稱為“唐氏綜合癥關(guān)鍵區(qū)域(Down syndrome critical region, DSCR)", DSCR1是臨近這個(gè)區(qū)域21q22.12所表達(dá)的蛋白,其過(guò)量表達(dá)被認(rèn)為是DS癥狀的主要分子病理病因。 DSCR1又被稱為鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(Regulator of calcineurin1, RCAN1),其可與酶亞基A相互結(jié)合,從而降低了鈣調(diào)磷酸酶的活性,導(dǎo)致下游底物活化T細(xì)胞核因子(Nuclear factor of activated T cells, NFAT)脫磷酸化作用減弱,不能轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。RCAN1-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路失衡被認(rèn)為與DS發(fā)病的分子機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn),DS患者大腦中鈣調(diào)磷酸酶的活性明顯降低,同樣,在AD患者中鈣調(diào)磷酸酶的活性也顯著下降,致使tau蛋白高度磷酸化,形成具有AD病理特征性的神經(jīng)纖維纏結(jié)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在DS和AD患者大腦中RCAN1均被檢測(cè)到有過(guò)量表達(dá),約為正常人的2-3倍。這些研究均提示RCAN1可能在DS和AD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。 具有神經(jīng)毒性的β淀粉樣蛋白(Amyloid-β peptide, Aβ)在腦中的沉積被認(rèn)為是AD的標(biāo)志性病理現(xiàn)象之一。Ap主要是由p分泌酶和Y分泌酶依次酶切β淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid-β precursor protein, APP)而產(chǎn)生。p分泌酶1(Beta-site APP-cleaving enzyme1, BACE1)是最主要的p分泌酶,其可酶切APP的兩個(gè)位點(diǎn)形成具有99或89個(gè)氨基酸的C末端片段(C99,C89),在病理情況下,C99被γ分泌酶進(jìn)一步酶切,產(chǎn)生Aβ和C末端小片段。而在生理情況下,APP主要由α分泌酶在Aβ區(qū)域內(nèi)部酶切,形成具有83個(gè)氨基酸的C末端片段(C83),C83進(jìn)而被γ分泌酶酶切,生成無(wú)毒性的p3和C末端小片段。BACE1從產(chǎn)生到成熟經(jīng)歷了復(fù)雜的翻譯后加工過(guò)程,其中包括了4個(gè)位點(diǎn)的N端糖基化(Asn153,172,223,354)。γ分泌酶是一組蛋白復(fù)合體,其中多個(gè)亞基同樣為N端糖基化蛋白。研究表明,BACE1的糖基化程度與其成熟度和活性密切相關(guān),而γ分泌酶亞基的成熟度下降也會(huì)導(dǎo)致整個(gè)復(fù)合體的酶活性降低。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在DS患者中,成熟型的BACE1過(guò)量表達(dá),可能是導(dǎo)致DS患者腦中Aβ沉積,出現(xiàn)類似于AD的癡呆癥狀的主要原因。然而,導(dǎo)致成熟型的BACE1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚。 RCAN1已被認(rèn)為和神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元凋亡等多種神經(jīng)退行性病變的分子病理機(jī)制相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)RCAN1可以促使BACE1和γ分泌酶活性亞基NCT (Nicastrin)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化增加,成熟形態(tài)的蛋白過(guò)度表達(dá)。N端糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后加工過(guò)程,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要受到寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(Oligosaccharyltransferase, OST)調(diào)控。OST主要催化核心寡糖鏈轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成肽鏈的天冬酰胺殘基上形成N-糖苷鍵,從而完成了N端糖基化的起始關(guān)鍵步驟之一。本研究發(fā)現(xiàn)RCAN1可以與OST的亞基之一,核糖體結(jié)合蛋白1(Ribophorin I,RPNI)直接作用,上調(diào)了OST的酶活性。因此高表達(dá)RCAN1可以促使多種N端糖基化蛋白成熟度增加,過(guò)度成熟的BACE1和NCT均參與了對(duì)APP的酶切過(guò)程,最終導(dǎo)致Ap的表達(dá)上升,產(chǎn)生一系列的神經(jīng)退行性癥狀。 本文進(jìn)一步闡明了RCAN1在DS發(fā)病中的關(guān)鍵作用,為探討AD的分子病理基礎(chǔ)提供了一條新思路。本研究不僅從一個(gè)新的角度詮釋了RCAN1這一高度保守的關(guān)鍵基因在生命體中的重要功能,也對(duì)治療AD患者的臨床癥狀提供了一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)。 第一部分RCAN1上調(diào)BACE1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化 為了驗(yàn)證RCAN1是否影響B(tài)ACE1的糖基化,我們首先在體外實(shí)驗(yàn)中使用pRCAN1-myc和pBACE1-mycHis質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。人類BACE1含有4個(gè)N端糖基化位點(diǎn),由于糖基化程度的不同,在SDS-PAGE Westen Blot檢測(cè)中呈現(xiàn)出成熟型和非成熟型兩條條帶。我們發(fā)現(xiàn)RCAN1對(duì)成熟型和非成熟型的BACE1都有顯著的上調(diào)作用。同時(shí),使用N端糖基化阻斷劑衣霉素(Tunicamycin)可以完全阻斷BACE1成熟型和非成熟型蛋白的生成,使之轉(zhuǎn)化成非糖基化的蛋白形態(tài),提示成熟型和非成熟型BACE1蛋白均含有N端糖基化修飾。但是,使用小干擾RNA (Si-RNA)干擾RCAN1的表達(dá)之后,我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BACE1的表達(dá)有明顯下降。 N端糖基化修飾發(fā)生于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中。我們使用了兩種不同的糖苷酶——糖苷內(nèi)切酶H (endo-glycosidase H, Endo H)和肽N端糖苷內(nèi)切酶F (Peptide-N-Glycosidase-F, PNGaseF)來(lái)檢測(cè)RCAN1對(duì)BACE1N端糖基化影響的定位。EndoH可以水解在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)加上的高甘露糖鏈和部分N端雜糖鏈,而PNGaseF可以水解幾乎所有的復(fù)雜N端糖鏈。經(jīng)糖苷酶處理后,PNGaseF將BACE1完全酶切成非糖基化形態(tài),而EndoH則僅將非成熟的BACE1酶切成低糖基化形態(tài),同時(shí)RCAN1對(duì)成熟型BACE1的上調(diào)作用消失,提示RCAN1對(duì)BACE1的調(diào)控作用主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,我們使用蔗糖密度梯度離心法分離了細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,非成熟型的BACE1儀存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,且RCAN1的上調(diào)作用仍然十分顯著。這些結(jié)果提示RCAN1主要影響了BACE1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化。 第二部分RCAN1對(duì)蛋白糖基化的調(diào)控作用具有非特異性 為了探討RCANl對(duì)BACE1糖基化的影響是否具有特異性,我們引入了另外兩種N端糖基化蛋白——BACE2和NCT。其中,BACE2是BACE1的同源異構(gòu)體,NCT是丫分泌酶亞基之一,二者均影響Ap的生成。Western Blot顯示RCAN1上調(diào)了BACE2和NCT的蛋白水平,衣霉素同樣可以使BACE2和NCT轉(zhuǎn)化成非糖基化形態(tài)。PNGaseF處理可以使BACE2轉(zhuǎn)化成非糖基化形態(tài),而EndoH可以將BACE2酶切成低糖基化形態(tài),提示BACE2和BACE1一樣具有復(fù)雜的N端糖基化修飾。而PNGaseF和EndoH均能將NCT水解成非糖基化形態(tài),提示NCT的糖基化修飾完全存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。使用蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RCAN1對(duì)BACE2和NCT蛋白的上調(diào)作用主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。以上結(jié)果提示RCAN1對(duì)蛋白糖基化的調(diào)控具有非特異性。 第三部分RCAN1上調(diào)β分泌酶和γ分泌酶的活性進(jìn)而增加β淀粉樣蛋白的生成 為了研究RCAN1對(duì)BACE1和NCT的糖基化調(diào)控是否影響了β分泌酶和Y分泌酶的活性,我們用pBACE1-mycHis和pAPP-myc和質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RCAN1可以顯著增加p分泌酶酶切產(chǎn)物C99的表達(dá),這種上調(diào)作用在使用Si-NCT抑制丫分泌酶活性的情況下依然存在,提示RCAN1增強(qiáng)了BACE1的酶切活性。Norch蛋白是γ分泌酶的主要作用底物之一,為了驗(yàn)證RCAN1是否對(duì)γ分泌酶活性產(chǎn)生影響,我們構(gòu)建了對(duì)Norch信號(hào)通路有指示作用的HES-1質(zhì)粒。對(duì)HES-1的啟動(dòng)子活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RCAN1對(duì)γ分泌酶的活性有顯著的上調(diào)作用。 為了進(jìn)一步檢測(cè)RCAN1對(duì)p分泌酶和γ分泌酶的影響是否促進(jìn)了下游酶切產(chǎn)物Ap的生成,我們使用8M urea tricine gel來(lái)分離并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的Ap含量。研究發(fā)現(xiàn),RCAN1明顯上調(diào)了Aβ40和Aβ42的蛋白水平。同樣,使用ELISA法也證實(shí)RCAN1可以促使Aβ40的表達(dá)增加。以上結(jié)果說(shuō)明RCAN1通過(guò)上調(diào)p分泌酶和丫分泌酶的活性增加了Ap的生成。 第四部分RCAN1可以與OST的亞基RPN I直接作用從而上調(diào)OST的酶活性 為了進(jìn)一步驗(yàn)證RCAN1同樣可以影響其他糖基化蛋白的糖基化修飾,我們使用了Pro-Q Emerald糖蛋白檢測(cè)法和刀豆蛋白A來(lái)顯示全細(xì)胞糖蛋白。Pro-Q Emerald檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RCAN1的細(xì)胞中糖蛋白的信號(hào)明顯增強(qiáng),而刀豆蛋白A Western Blot顯示糖蛋白的表達(dá)增加主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而非高爾基體中,進(jìn)一步驗(yàn)證了RCAN1對(duì)糖蛋白的調(diào)控作用是非特異的。我們進(jìn)而合成了具有N端糖基化位點(diǎn)的多肽GNSTVT,采用洋地黃毛苷(Digitonin)半通透法將其轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞內(nèi)。我們發(fā)現(xiàn)RCAN1明顯上調(diào)了多肽的糖基化形態(tài),進(jìn)一步提示了RCAN1對(duì)糖基化蛋白的影響是普遍存在的。 N端糖基化是一種復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程,其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的核心步驟由OST催化完成。我們構(gòu)建了OST的亞基質(zhì)粒STT3A, RPN I, RPNⅡ和OSTC,與RCAN1共轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn),盡管OST核心組分的STT3A的表達(dá)沒(méi)有明顯變化,RPN I, RPN II和OSTC的表達(dá)都有上升。有趣的是,阻斷RCAN1的表達(dá)也觀察到了RPNⅠ, RPNⅡ和OSTC這三個(gè)OST亞基的表達(dá)下降。最近的研究發(fā)現(xiàn),OST單一亞基的下調(diào)可以影響其他亞基的功能,從而導(dǎo)致整個(gè)OST的活性下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),上調(diào)任何一個(gè)OST亞基的表達(dá)均能對(duì)增加BACE1成熟和非成熟形態(tài)的表達(dá),以非成熟形態(tài)更為顯著,類似于上調(diào)RCAN1的作用效果。因此,RCAN1可能影響了OST的穩(wěn)定性進(jìn)而對(duì)N端糖基化修飾產(chǎn)生影響。 為了證實(shí)RCAN1是否與OST有直接關(guān)聯(lián),我們使用了co-IP方法來(lái)檢測(cè)RCAN1和OST亞基的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有RPNI co-IP檢測(cè)到了RCAN1的蛋白條帶。RPNI可以調(diào)控底物遞呈給OST核心組分的過(guò)程,一些分泌蛋白,如轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)勺糖基化修飾不受RPNI調(diào)控。Western Blot檢測(cè)顯示,僅OST的核心組分STT3A的上調(diào)促進(jìn)了Transferrin的表達(dá),RPNⅠ, RPNⅡ和OSTC都未對(duì)Transferrin的表達(dá)產(chǎn)生影響。同樣,上調(diào)RCAN1沒(méi)有檢測(cè)至Transferring勺表達(dá)變化。因此我們推測(cè)RCAN1對(duì)OST的調(diào)控主要是通過(guò)不RPNⅠ的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 綜上所述 1、本研究證實(shí)了RCAN1對(duì)OST有調(diào)控作用,這種調(diào)控作用是通過(guò)和OST亞基RPNI的直接作用,增強(qiáng)了OST的穩(wěn)定性和活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。OST由多個(gè)亞基組成,其核心成分為STT3A,我們的研究發(fā)現(xiàn)RCAN1對(duì)STT3A的作用不顯著,提示RCAN1可能是OST的非核心組分。 2、通過(guò)對(duì)OST的調(diào)控作用,RCAN1的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)一系列蛋白的糖基化修飾過(guò)程,包括BACE1, BACE2和NCT。同樣RCAN1可以影響具有N端糖基化位點(diǎn)多肽GNSTVT勺成熟形態(tài)表達(dá),但對(duì)僅受OST核心組分STT3A調(diào)控的分泌蛋白Transferrin的作用效果不大。 3、RCAN1通過(guò)上調(diào)p分泌酶和γ分泌酶糖基化修飾,使其成熟度和酶切活性增高,增加了Ap的生成,導(dǎo)致DS患者出現(xiàn)類似于AD的癡呆和認(rèn)知功能障礙等癥狀。這為闡明AD患者中RCAN1高表達(dá)的分子病理機(jī)制提供了一條新思路。
【關(guān)鍵詞】：鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1 N端糖基化 寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體 β淀粉樣蛋白
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.1
【目錄】：

• 中文摘要8-15
• ABSTRACT15-23
• 符號(hào)說(shuō)明23-24
• 1. 前言24-33
• 1.1 鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(RCAN1)24-27
• 1.2 β淀粉樣蛋白(Aβ)27-29
• 1.3 寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(OST)29-33
• 2. 材料與方法33-53
• 2.1 試劑33-36
• 2.2 儀器36-37
• 2.3 質(zhì)粒構(gòu)建37-40
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)40-41
• 2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染41
• 2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因分析41-42
• 2.7 蛋白質(zhì)的半衰期檢測(cè)42
• 2.8 反轉(zhuǎn)錄PCR42-45
• 2.9 三氯乙酸蛋白沉淀45
• 2.10 蔗糖密度梯度離心45-46
• 2.11 糖苷內(nèi)切酶處理蛋白46
• 2.12 OST活性檢測(cè)46-47
• 2.13 Western Blot蛋白分析47-49
• 2.14 糖蛋白檢測(cè)49-51
• 2.15 免疫共沉淀(CO-IP)51
• 2.16 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)51-52
• 2.17 數(shù)據(jù)分析52-53
• 3. 結(jié)果53-72
• 3.1 RCAN1上調(diào)BACE1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的N端糖基化53-58
• 3.2 RCAN1對(duì)蛋白糖基化的調(diào)控具有非特異性58-61
• 3.3 RCAN1上調(diào)β分泌酶和γ分泌酶的活性進(jìn)而增加β淀粉樣蛋白的生成61-66
• 3.4 RCAN1可以與OST的亞基RPN工直接作用進(jìn)而上調(diào)OST的酶活性66-72
• 4. 討論72-76
• 5. 結(jié)論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-85
• 致謝85-86
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄86-88
• 綜述88-103
• 參考文獻(xiàn)95-103
• 外文論文103-156
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表156

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 涂玲輝;劉海朋;駱靜;;鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)因子RCANs的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2010年01期

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本文編號(hào)：664214