本文關鍵詞：Gx-50通過小膠質(zhì)細胞受體α7 nAChR及TLR4介導的抗炎作用

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【摘要】：阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,表現(xiàn)為認知損傷和漸進性記憶障礙。其主要的病理特征是胞外β淀粉樣蛋白(βamyloid,Aβ)沉積形成老年斑和胞內(nèi)tau蛋白超磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。該病的病理機制十分復雜,與多種信號通路和因素相關,如Aβ、tau蛋白、神經(jīng)元損傷、慢性炎癥等。在眾多機制中,腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞介導的慢性神經(jīng)炎癥被認為與阿爾茲海默癥的發(fā)生和發(fā)展有重要聯(lián)系,從而受到廣泛的關注和研究。研究目的:實驗室前期研究表明,一種花椒中提取的天然化合物N-[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl]-3-phenyl-acrylamide(gx-50)對AD有顯著的治療作用,主要包括神經(jīng)元保護、認知能力改善、抗Aβ聚集等功能;其次,基因芯片等結(jié)果表明,在原代的神經(jīng)元中,與AD發(fā)生過程相關的一些基因、分子和信號通路也會在一定程度上受到gx-50的影響;此外,在小膠質(zhì)細胞中,gx-50也表現(xiàn)出抑制Aβ誘導的趨化反應的作用。但目前并沒有針對其在神經(jīng)炎癥反應方面的功能進行詳細的研究�？紤]到神經(jīng)炎癥在AD的發(fā)生和發(fā)展中具有的重要的作用,我們設計了一系列生物學實驗來探究gx-50對Aβ誘導的炎癥反應的是否具有以及如何產(chǎn)生抑制作用。研究方法:本實驗的主要檢測對象是Aβ誘導的小膠質(zhì)細胞(BV2小膠質(zhì)瘤細胞系和原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞)及gx-50腹腔注射后APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織,通過檢測其中的細胞因子、通路蛋白、受體等來確定gx-50對Aβ誘導的炎癥反應的作用及其機制。通過炎癥反應中的重要的促炎介質(zhì)的檢測確定gx-50的抗炎作用。分別用ELISA和Griess法檢測細胞分泌的TNF-α、IL-1β、PGE2及NO等促炎介質(zhì)的含量,并且用real-time PCR和Western blot方法檢測組織或細胞內(nèi)的IL-1β、COX2及i NOS表達。然后用免疫熒光的方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片中小膠質(zhì)細胞活化情況。針對gx-50與α7 nAChR及其下游介導的抗炎通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的關系進行研究。通過gx-50與α-Btx競爭性結(jié)合實驗驗證gx-50與α7 nAChR的結(jié)合作用,然后分別用real-time PCR和Western blot針對該受體m RNA及蛋白的表達情況進行研究,以確定gx-50對該受體表達是否有影響。此外,通過免疫熒光和Western blot的方法檢測JAK2、STAT3、PI3K及AKT蛋白磷酸化水平從而確定α7 nAChR介導的JAK2/STAT3和PI3K/AKT信號通路的活化情況,并且通過分別加入α7nAChR、JAK2及PI3K特異性抑制劑α-Btx,AG490和LY294002來進一步驗證gx-50與這兩個通路的關系。然后,將細胞分別用α-Btx,AG490和LY294002等抑制劑預處理,再用Western blot和ELISA檢測IL-1β的表達變化情況,以確定gx-50的抗炎作用是否與α7nAChR及其介導的抗炎通路相關。針對gx-50對TLR4及其下游介導的炎癥通路NF-κB及MAPK的關系進行研究。通過real-time PCR和Western blot檢測體內(nèi)體外TLR4的m RNA和蛋白表達及TLR4招募蛋白My D88和TRAF6的蛋白表達情況。此外,通過免疫熒光和Western blot的方法檢測NF-κB p65及IκB、p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平從而確定TLR4介導的NF-κB及MAPK信號通路的活化情況。然后,分別用si RNA及過表達質(zhì)粒干擾和過表達TLR4,通過對TLR4介導的信號通路的抑制和活化情況進一步確定gx-50對該受體介導的炎癥通路的影響。研究結(jié)果:Gx-50在體內(nèi)體外對Aβ誘導的神經(jīng)炎癥均有顯著的抑制作用。對小膠質(zhì)細胞促炎介質(zhì)的檢測結(jié)果表明Aβ能刺激小膠質(zhì)細胞中促炎介質(zhì)的釋放,包括TNFα(998.43±26.29 pg/ml),IL-1β(437.97±72.84 ng/ml),PGE2(58.72±3.41 ng/ml)及NO(3.13±0.34μM),而gx-50預處理后這些促炎介質(zhì)的表達量顯著地下降,分別為695.29±74.56 pg/ml,293.17±10.26 ng/ml,37.05±2.15 ng/ml和1.55±0.05μM。此外,Western blot結(jié)果進一步證實了gx-50能顯著抑制COX2和i NOS的表達。對APP-Tg小鼠腦中促炎介質(zhì)的檢測結(jié)論與小膠質(zhì)細胞結(jié)論一致,gx-50能顯著地抑制Aβ刺激的促炎介質(zhì)IL-1β,COX2和i NOS的m RNA及蛋白表達。免疫熒光結(jié)果顯示gx-50可以抑制小膠質(zhì)細胞的活化。Gx-50的抗炎機制可能與α7nAChR及下游通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT相關。gx-50可以與α7 nAChR相結(jié)合,且不論是在正�；虿±砬闆r下,gx-50均能上調(diào)該受體表達。對α7 nAChR介導的信號通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的檢測結(jié)果顯示,gx-50能上調(diào)JAK2、STAT3、PI3K和AKT的蛋白磷酸化,而AG490、LY294002及α-Btx預處理分別抑制了gx-50這一作用,說明了gx-50通過α7nAChR的激活調(diào)控JAK2/STAT3和PI3K/AKT信號通路。此外,抑制劑α-Btx、AG49和LY294002的預處理抑制了gx-50對Aβ誘導的IL-1β的下調(diào)作用。在病理條件下,gx-50能直接抑制TLR4介導的炎癥通路。gx-50可以抑制TLR4的活化,在Aβ或APP+/saline組中TLR4,My D88和TRAF6的表達顯著地增加了,gx-50預處理后其表達量均受到了顯著地抑制。對體內(nèi)體外TLR4介導的炎癥通路NF-κB及MAPK的檢測結(jié)果顯示,gx-50能顯著抑制這兩個炎癥通路蛋白磷酸化水平。gx-50能抑制Aβ42誘導的IκB的磷酸化表達及NF-κB p65蛋白入核,從而抑制其對下游促炎基因的調(diào)控;免疫熒光結(jié)果進一步證實了這一點:Aβ刺激NF-κB p65入核,而與其相比,gx-50預處理后NF-κB p65更集中于胞漿中。此外,gx-50能顯著地抑制Aβ42誘導的p-ERK1/2,p-p38的表達水平。上述結(jié)果表明gx-50顯著地抑制了Aβ誘導的TLR4介導的炎癥通路的活化。然而,當si RNA干擾TLR4表達時,以IL-1β和TRAF6為例,它們的表達量受到了顯著的抑制,與未干擾組相比下降了50%,該效果與gx-50相一致,當TLR4過表達后,gx-50仍對My D88和TRAF6的表達起到抑制作用,使其表達量分別下降了38%和15%。綜上所述,gx-50表現(xiàn)出強烈的抗炎作用,該作用體現(xiàn)在多個方面。首先,gx-50能激活炎癥負反饋通路。gx-50能與α7nAChR相結(jié)合,使其激活進而導致下游通路JAK2/STAT3和PI3K/AKT的激活,而這兩個通路對炎癥通路起到負調(diào)控作用,進而起到抗炎作用。另一方面,gx-50能抑制炎癥通路。gx-50能抑制Aβ誘導的TLR4激活,進而導致其下游招募蛋白My D88和TRAF6的減少,從而導致炎癥通路NF-κB及MAPK的抑制,最終起到了抗炎作用。
【關鍵詞】：阿爾茲海默癥 炎癥反應 小膠質(zhì)細胞 gx-50 "7 nAChR/TLR4
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-21
• 第一章 緒論21-39
• 1.1 阿爾茲海默癥21-23
• 1.2 β 淀粉樣蛋白與AD23-27
• 1.2.1 β 淀粉樣蛋白生成23
• 1.2.2 淀粉樣蛋白假說及Aβ 在AD中的作用23-27
• 1.3 小膠質(zhì)細胞與AD27-28
• 1.3.1 小膠質(zhì)細胞功能簡介27
• 1.3.2 小膠質(zhì)細胞在AD中的作用27-28
• 1.4 炎癥與AD的關系28-31
• 1.4.1 炎癥在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用28-29
• 1.4.2 慢性神經(jīng)炎癥與AD的關系29-31
• 1.5 α7 煙堿型乙酰膽堿受體與AD31-33
• 1.5.1 α7 煙堿型乙酰膽堿受體的功能31-32
• 1.5.2 α7 nAChR抗炎作用32-33
• 1.6 關于AD的藥物研究33-39
• 1.6.1 AD臨床治療藥物現(xiàn)狀及AD藥物研究幾大方向33-34
• 1.6.2 抗炎藥物研究34-36
• 1.6.3 gx-50 的相關研究36-39
• 第二章 gx-50 對 α7 nAChR及其下游通路的作用39-74
• 2.1 背景介紹39-40
• 2.2 實驗材料及儀器40-42
• 2.3 試劑配制42-44
• 2.4 實驗方法44-52
• 2.4.1 BV2小膠質(zhì)系細胞培養(yǎng)及加藥處理44-45
• 2.4.2 CCK8細胞活性檢測45
• 2.4.3 受體結(jié)合實驗45
• 2.4.4 從細胞中提取RNA及反轉(zhuǎn)錄45-46
• 2.4.5 熒光實時定量PCR（Quantitative Real time PCR ）檢測46-47
• 2.4.6 從細胞中提取蛋白47-48
• 2.4.7 免疫蛋白印跡（Western Blot）檢測48-50
• 2.4.8 細胞免疫熒光分析50
• 2.4.9 細胞因子檢測50-51
• 2.4.10 統(tǒng)計學方法51-52
• 2.5 實驗結(jié)果52-69
• 2.5.1 gx-50 可與 α7 nAChR結(jié)合并影響其表達52-56
• 2.5.2 gx-50 對JAK2活化的影響56
• 2.5.3 gx-50 對STAT3活化的影響56-60
• 2.5.4 gx-50 對PI3K活化的影響60-63
• 2.5.5 gx-50 對AKT活化的影響63
• 2.5.6 gx-50 對小膠質(zhì)細胞炎癥介質(zhì)表達的影響63-67
• 2.5.7 α7 nAChR抑制后gx-50 對炎性因子IL-1β 的影響67-69
• 2.6 結(jié)果討論69-74
• 第三章 gx-50 對Aβ 誘導的神經(jīng)炎癥的影響74-110
• 3.1 背景介紹74-75
• 3.2 實驗材料及儀器75-76
• 3.3 試劑配制76-77
• 3.4 實驗方法77-86
• 3.4.1 大鼠原代小膠質(zhì)細胞分離和培養(yǎng)77
• 3.4.2 流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）鑒定小膠質(zhì)細胞77-78
• 3.4.3 癡呆小鼠模型78
• 3.4.4 從細胞/組織中RNA提取及反轉(zhuǎn)錄78-79
• 3.4.5 熒光實時定量PCR（Quantitative Real time PCR ）檢測79-80
• 3.4.6 從細胞/組織中提取蛋白80
• 3.4.7 小膠質(zhì)細胞漿蛋白及核蛋白提取80-81
• 3.4.8 Western Blot81-82
• 3.4.9 轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織切片免疫熒光雙染色分析82-83
• 3.4.10 siRNA干擾TLR4表達實驗83
• 3.4.11 小鼠tlr4原核表達質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染83-86
• 3.4.12 統(tǒng)計學方法86
• 3.5 實驗結(jié)果86-104
• 3.5.1 原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞的鑒定86
• 3.5.2 gx-50 對轉(zhuǎn)基因小鼠炎癥介質(zhì)表達的影響86-90
• 3.5.3 gx-50 對轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化的影響90-92
• 3.5.4 gx-50 對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及IκB的影響92-95
• 3.5.5 gx-50 對MAPKs通路磷酸化的影響95-97
• 3.5.6 gx-50 對TLR4及其下游招募蛋白的影響97-99
• 3.5.7 TLR4敲除后gx-50 對該通路的影響99-101
• 3.5.8 TLR4過表達后gx-50 對該通路的影響101-104
• 3.6 結(jié)果討論104-110
• 第四章 全文總結(jié)110-112
• 參考文獻112-124
• 致謝124-126
• 攻讀碩士學位期間已發(fā)表或錄用的論文126-128

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