本文關(guān)鍵詞：seipin缺失對情感和認(rèn)知行為的影響及其機制研究

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【摘要】：先天性全身脂肪營養(yǎng)不良Ⅱ型(congenital generalized lipodystrophy type 2, CGL2)的臨床特征是全身脂肪組織減少、脂糖代謝異常、精神發(fā)育遲滯(mental retardation)。精神發(fā)育遲滯主要是指抑郁或焦慮等情感的障礙、認(rèn)知功能的低下。11號染色體長臂的seipin基因無義突變(seipin缺失)被認(rèn)為是CGL2的主要病理機制。seipin蛋白主要表達(dá)在脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和睪丸細(xì)胞。有研究證明,脂肪細(xì)胞的seipin缺失通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARy)的表達(dá)和活性,能阻礙脂肪細(xì)胞的分化,導(dǎo)致脂肪細(xì)胞缺失。睪丸細(xì)胞seipin缺失可引起精子形態(tài)畸形。原位雜交檢測結(jié)果顯示seipin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大腦皮層、海馬、下丘腦、腦干和小腦等腦區(qū)選擇性高表達(dá)。但是有關(guān)seipin缺失對情感和認(rèn)知行為的影響迄今未見報道。抑郁癥患者腦內(nèi)PPARγ水平明顯低于正常人群。臨床研究已報道,PPARγ激動劑能有效地改善抑郁癥患者的癥狀。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)患者腦內(nèi)的PPARy水平也低于非認(rèn)知障礙人群,PPARy激動劑能改善AD病人的認(rèn)知功能。PPARy下調(diào)能抑制ERK1/2-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號通路的活性。海馬突觸傳遞的NMDA受體依賴型長時程增強(LTP)被認(rèn)為是認(rèn)知記憶的細(xì)胞模型,LTP的誘導(dǎo)依賴于胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白啟動ERK1/2-CREB信號通路。有研究發(fā)現(xiàn)雌激素能正向調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)。此外,Wei等報道了原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的seipin敲低能減少谷氨酸受體的表達(dá)和NMDA受體在細(xì)胞膜的分布。因此,神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失有可能通過降低腦的PPARγ水平影響情感和認(rèn)知行為。研究目的1、明確seipin缺失對小鼠情感行為的影響及其性別差異。2、探討seipin缺失對小鼠空間認(rèn)知行為的影響及其分子機制。第一部分seipin缺失對小鼠情感行為的影響及其性別差異實驗方法1.動物模型的制備和鑒定：全身seipin基因敲除(seipin-sKO)、神經(jīng)系統(tǒng)seipin基因敲除(seipin-nKO)和脂肪細(xì)胞seipin基因敲除(seipin-fKO)小鼠模型由北京大學(xué)劉國慶教授提供。提取尾部DNA,用PCR方法鑒定基因型。2.動物行為學(xué)檢測：(1)開場實驗(OFT)：記錄運動的總路程、直立次數(shù),分析自發(fā)活動情況；在中央?yún)^(qū)域的時間反映焦慮樣行為。(2)高架十字迷宮實驗(EPM)：記錄在開臂的時間,分析焦慮樣行為。(3)強迫游泳實驗(FST)：記錄保持不動的累積時間,分析抑郁樣行為。(4)懸尾實驗(TST)：記錄保持不動的累積時間,分析抑郁樣行為。(5)游泳實驗：記錄游泳的時間,以游泳速度(距離／時間)分析運動功能。(6)轉(zhuǎn)輪實驗：記錄不同轉(zhuǎn)速下的掉落潛伏期,分析運動協(xié)調(diào)功能。3.激素水平檢測：放射免疫法檢測血清雌激素、睪酮水平；ELISA檢測血清皮質(zhì)酮水平。4.實時定量逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot):檢測海馬和皮層PPARy mRNA和蛋白水平。實驗結(jié)果1.與野生型(WT)小鼠相比,seipin-sKO雄／雌鼠顯示全身脂肪嚴(yán)重缺失,在OFT中央?yún)^(qū)域時間和在EPM開臂時間顯著減少,在FST和TST的不動時間明顯延長；在游泳實驗中的游泳速度、轉(zhuǎn)輪實驗中的掉落潛伏期沒有明顯改變——seipin映失誘發(fā)焦慮-抑郁樣行為,但不影響運動功能。2.與對照組雄鼠相比,seipin-nKO雄鼠沒有脂肪組織的減少,但是顯示OFT中央?yún)^(qū)域時間和EPM開臂時間顯著減少,以及FST和TST的不動時間明顯延長。同樣與對照組雌鼠相比,seipin-nKO雌鼠也沒有脂肪組織減少,在OFT中央?yún)^(qū)域時間、EPM開臂時間、FST和TST的不動時間均沒有明顯差異——神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失誘發(fā)性別相關(guān)的焦慮-抑郁樣行為。3.與對照組小鼠相比,seipin-fKO雄／雌鼠顯示全身脂肪組織萎縮,但是在OFT中央?yún)^(qū)域時間、EPM開臂時間、FST和TST的不動時間均沒有明顯差異——脂肪組織seipin缺失導(dǎo)致脂肪組織減少不影響情感行為。4.同對照組相比,seipin-nKO雄／雌鼠的雌激素、雄激素和皮質(zhì)酮水平均沒有明顯的改變。同WT雌鼠相比,seipin-sKO雌鼠的雌激素水平降低。5.雌激素處理能改善seipin-nKO雄鼠的焦慮-抑郁行為。seipin-nKO雌鼠的卵巢摘除能引起在EPM開臂停留時間減少,FST和TST的不動時間延長——雌激素能改善seipin缺失所致的情感障礙。6.與對照組相比,seipin-nKO雄鼠海馬皮層PPARγ mRNA和蛋白水平明顯減少,但是seipin-nKO雌鼠的PPARγ表達(dá)沒有改變——seipir缺失能性別選擇性地減少神經(jīng)系統(tǒng)PPARγ表達(dá)。雌激素能增加seipin-nKO雄鼠PPARγ表達(dá),卵巢摘除導(dǎo)致seipin-nKO雌鼠的PPARγ減少——雌激素能緩解seipin缺失所致的PPARγ低表達(dá)。7. PPARy激動劑羅格列酮14天處理能改善seipin-nKO雄鼠焦慮-抑郁樣行為。結(jié)論(1)神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失通過抑制PPARγ表達(dá)誘發(fā)焦慮-抑郁樣行為。(2)雌激素能增加PPARγ表達(dá),通過改善seipin缺失所致的PPARy水平降低,能緩解seipin-nKO小鼠的焦慮-抑郁樣行為。第二部分seipin缺失對認(rèn)知行為的影響及其分子機制實驗方法1.動物模型的制備和鑒定:同第一部分。2.認(rèn)知行為的檢測:采用Morris水迷宮,記錄明臺實驗的游泳速度,檢測運動協(xié)調(diào)性和視覺靈敏性;記錄暗臺實驗的登臺潛伏期、撤臺實驗的目標(biāo)象限停留時間,分析空間學(xué)習(xí)記憶能力。3.場電位記錄:制備海馬冠狀切片,檢測海馬Schaffer側(cè)支-CA1突觸的興奮性突觸后電位(EPSP)、雙脈沖易化(PPF)以及高頻刺激(HFS,100Hz-100pulses)或θ條件刺激(100Hz-10 pulses)對長時程增強(LTP)的誘導(dǎo)。4.全細(xì)胞膜片鉗記錄:制備海馬冠狀切片,檢測腦片海馬CA1錐體神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的電流(NMDA-indcued current,INMDA)和AMPA受體介導(dǎo)的電流(AMPA-indcued current,IAMPA)。5.酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA):檢測海馬BDNF的水平。6.RT-PCR:檢測谷氨酸AMPA受體和NMDA受體亞基m RNA水平。7.Western blotting:檢測AMPA受體和NMDA受體亞基的表達(dá),以及ERK1/2和CREB的磷酸化水平。實驗結(jié)果1.與WT雄鼠相比,seipin-s KO雄鼠在水迷宮實驗中登臺潛伏期明顯延長、撤臺后在目標(biāo)象限時間減少。與對照雄鼠相比,seipin-n KO雄鼠也表現(xiàn)登臺潛伏期明顯延長和目標(biāo)象限時間減少,但是seipin-f KO小鼠沒有顯示登臺潛伏期和目標(biāo)象限游泳時間的改變——神經(jīng)系統(tǒng)seipin缺失導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。2.與對照組相比,seipin-n KO雄鼠海馬Schaffer側(cè)支-CA1突觸的EPSP斜率明顯降低,不伴有PPF的比值改變——seipin缺失誘導(dǎo)突觸傳遞功能降低,但不影響突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。3.在對照組雄鼠,高頻刺激或θ條件刺激海馬Schaffer側(cè)支能引起CA1區(qū)EPSP斜率的長時程增加,即LTP的產(chǎn)生。但是,在seipin-n KO雄鼠同樣的條件刺激不能誘導(dǎo)LTP——seipin缺失損害LTP誘導(dǎo)。4.同對照組相比,seipin-n KO雄鼠海馬CA1錐體神經(jīng)元NMDA誘導(dǎo)的電流(INMDA)沒有差異,但是谷氨酸AMPA誘導(dǎo)的電流(IAMPA)幅值顯著減小。seipin-n KO雄鼠海馬AMPA受體亞基Glu R1和Glu R2 m RNA和蛋白水平明顯低于對照組,但是NMDA受體亞基(NR1、NR2A和NR2B)表達(dá)沒有改變——seipin缺失選擇性抑制AMPA受體表達(dá)。5.與對照組相比,seipin-n KO雄鼠海馬BDNF水平?jīng)]有改變;ERK和CREB磷酸化水平明顯降低——seipin缺失抑制ERK-CREB信號活性。6.seipin-n KO雄鼠給予PPARγ激動劑羅格列酮3天處理能顯著提高ERK和CREB磷酸化水平,增加AMPA受體表達(dá)和IAMPA幅值。MEK抑制劑U0126可以阻斷羅格列酮增加CREB的磷酸化——seipin缺失通過減少PPARγ水平抑制AMPA受體表達(dá)和功能。7.seipin-n KO小鼠給予PPARγ激動劑羅格列酮能恢復(fù)突觸傳遞功能及LTP誘導(dǎo),改善seipin-n KO小鼠的認(rèn)知障礙。U0126可以阻斷羅格列酮恢復(fù)AMPA受體的表達(dá)和功能,以及LTP誘導(dǎo)——seipin缺失通過抑制AMPA受體表達(dá)導(dǎo)致認(rèn)知障礙。結(jié)論seipin缺失引起PPARγ的表達(dá)下降能抑制ERK-CREB信號活性,從而減少谷氨酸AMPA受體的表達(dá),阻礙LTP誘導(dǎo),最終導(dǎo)致認(rèn)知障礙。臨床意義本研究的結(jié)果提示CGL2患者的精神發(fā)育遲滯可能與神經(jīng)系統(tǒng)的PPARγ水平降低有關(guān),因此PPARγ激動劑的使用有可能會改善CGL2患者的認(rèn)知和情感障礙。
【關(guān)鍵詞】：seipin 焦慮 抑郁 PPARγ 雌激素 seipin PPARγ 學(xué)習(xí)認(rèn)知 BDNF AMPA受體
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 seipin缺失對情緒行為的影響及其性別差異17-42
• 前言17-19
• 材料和方法19-27
• 結(jié)果27-34
• 討論34-37
• 小結(jié)37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 第二部分 seipin缺失對認(rèn)知行為的影響及其分子機制研究42-66
• 前言42-43
• 材料和方法43-50
• 結(jié)果50-58
• 討論58-61
• 結(jié)論61
• 臨床意義61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 綜述66-78
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 英文縮寫及中英文全名對照表78-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況79-82
• 致謝82

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本文編號：642374