發(fā)布時間：2017-08-06 16:04

  本文關鍵詞：慢病毒介導的PDE4DmiRNA對抑郁癥和認知損傷的調節(jié)作用及其機制研究

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【摘要】：研究目的：磷酸二酯酶(phosphodiesterases, PDEs)是體內唯一負責水解第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的酶類。磷酸二酯酶4(phosphodiesterases4, PDE4)是PDEs家族成員之一,PDE4抑制劑的研究主要集中在呼吸系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病上,在臨床上主要用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘及銀屑病。近年來,越來越多的研究表明,PDE4可以通過多種途徑改善神經(jīng)系統(tǒng)疾病,例如抑郁癥、老年癡呆、腦卒中等。相應的抑制劑能夠通過調控細胞內cAMP水平從而改善疾病所致的抑郁癥狀和學習記憶障礙。但是幾乎所有的非選擇性抑制劑都會產(chǎn)生嚴重的胃腸道反應,限制了該類藥物的臨床使用。PDE4家族包含20多種亞亞型(由于mRNA初級產(chǎn)物經(jīng)酶的不同剪接形成,亦稱為剪接變異體),分布在細胞不同的區(qū)域從而發(fā)揮不同的作用。因此本課題的研究目的是利用慢病毒介導的PDE4DmiRNA沉默長鏈PDE4D的表達,在小鼠慢性不可預知性溫和刺激引起的抑郁癥模型和Aβ42海馬DG區(qū)微量注射誘導的認知損傷模型上闡明長鏈PDE4D(尤其是PDE4D4/5)對小鼠抑郁癥狀和學習記憶障礙的調節(jié)作用。課題分為三大部分：第一部分是構建并鑒定攜帶PDE4DmiRNA的慢病毒載體。第二部分是初步觀察慢病毒介導的PDE4DmiRNA對慢性不可預知性溫和刺激引起的小鼠抑郁行為的調節(jié)作用,檢測海馬組織cAMP通路的水平。第三部分是研究慢病毒介導的PDE4DmiRNA對正常小鼠學習記憶能力的影響,并進一步闡明慢病毒介導的PDE4DmiRNA對Aβ42誘導的學習記憶損傷模型中小鼠認知行為的調節(jié)作用及其對cAMP信號通路和促炎因子的影響。該研究為進一步闡明長鏈PDE4D在抑郁癥和認知障礙疾病中的作用提供實驗依據(jù)。 研究方法：(1)首先構建能轉錄產(chǎn)生PDE4D4miRNA的重組質粒,與慢病毒包裝質粒共轉染293T細胞產(chǎn)生高滴度慢病毒。體外感染培養(yǎng)的293T細胞檢測其轉染效率。采用腦立體定位技術在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒介導的PDE4DmiRNA引起目的基因表達沉默,14天后取海馬組織檢測PDE4DmiRNA對PDE4A/B/D以及PDE4D3/4/5的mRNA水平的影響。 (2)采用慢性不可預知性溫和刺激使小鼠接受應激67天,誘導產(chǎn)生小鼠抑郁樣癥狀,糖水偏愛實驗檢測小鼠抑郁程度。抑郁模型建立后,采用腦立體定位技術在小鼠海馬DG區(qū)微量注射慢病毒,14天后進行行為學實驗。強迫游泳實驗,懸尾實驗和糖水偏愛實驗反應小鼠抑郁狀態(tài)；高架十字迷宮實驗和曠場實驗反應小鼠的焦慮狀態(tài)；高效液相質譜聯(lián)用技術檢測小鼠海馬中cAMP水平；PCR技術和Western Blot技術分別檢測了小鼠海馬cAMP-PKA-CREB通路的變化。 (3)采用Morris水迷宮實驗,新物體識別實驗和跳臺實驗評價小鼠的學習記憶能力。小鼠雙側海馬DG區(qū)注射老化的Aβ42(0.5μg/side)誘導小鼠學習記憶損傷,24小時后注射慢病毒在同一位點,14天后采用水迷宮和新物體識別用來評價小鼠的學習記憶能力；高效液相質譜聯(lián)用技術檢測小鼠海馬中cAMP水平；PCR技術和Western Blot技術分別檢測了小鼠海馬cAMP-PKA-CREB通路以及炎癥因子的變化。 研究結果：(1)慢病毒轉染293T細胞72小時后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。無論攜帶陰性對照還是PDE4D基因序列的慢病毒均表現(xiàn)出強烈的熒光。在動物體內實驗中亦發(fā)現(xiàn)了相同的結果。而且,PDE4DmiRNA能顯著降低PDE4D, PDE4D4和PDE4D5的表達水平,而對PDE4A/B和PDE4D3的表達沒有顯著性影響。 (2)在小鼠經(jīng)歷慢性不可預知性溫和刺激過程中,應激小鼠在糖水偏愛實驗中的糖水偏愛度和小鼠體重與非應激組小鼠相比均明顯降低。給予慢病毒治療后,CUMS組小鼠在強迫游泳實驗和懸尾實驗中,不動時間顯著降低,且糖水偏愛率依然處于低態(tài),微量注射慢病毒后能夠逆轉CUMS引起的不動時間的減少,提高糖水偏愛率,改善小鼠抑郁樣癥狀。同時慢病毒逆轉CUMS引起的海馬cAMP水平的下降,增強海馬pCREB蛋白表達,增加BDNF mRNA水平,而不影響CREB的mRNA水平。 (3)小鼠持續(xù)給予rolipram或單次注射慢病毒14天后,rolipram顯著性減少小鼠到達平臺的潛伏期,增加跳臺實驗中的逃避潛伏期,起到增強記憶的作用。而且慢病毒介導的PDE4DmiRNA對學習記憶的增強作用不如rolipram效果明顯。慢病毒介導的PDE4DmiRNA可以逆轉Aβ42誘導的小鼠認知障礙。研究發(fā)現(xiàn)小鼠雙側海馬DG區(qū)注射老化的Aβ42(0.5μg/side)可以顯著減少小鼠水迷宮探索實中在平臺象限的停留時間和穿越次數(shù),新物體實驗訓練24小時后,Aβ42小鼠的識別指數(shù)與對照組相比顯著降低,說明Aβ42誘導小鼠產(chǎn)生學習記憶損傷。微量注射慢病毒后小鼠探索實驗中平臺象限的停留時間和穿越次數(shù)以及物體識別實驗中識別指數(shù)均顯著增加,表明慢病毒介導的PDE4DmiRNA能夠逆轉Aβ42引起的認知障礙,同時可以增強海馬pCREB和BDNF蛋白表達,減少IL-1β, TNF-α和NF-κB的水平。 結論：本課題從提高抑制PDE4靶點的特異性為出發(fā)點,構建了慢病毒介導的發(fā)夾結構的PDE4DmiRNA,特異性抑制PDE4D4/5的表達,微量注射小鼠海馬DG區(qū)后,慢病毒可以與宿主細胞整合并持續(xù)高表達,且PCR技術驗證了miRNA的沉默效率,為目的基因的沉默提供了可靠的實驗依據(jù)。繼而我們發(fā)現(xiàn),長鏈PDE4D表達降低可以增加海馬內第二信使cAMP水平,激活cAMP/PKA/CREB信號通路,進一步增加下游BDNF蛋白的表達,同時減少凋亡因子和促炎癥因子的產(chǎn)生,從而起到逆轉慢性不可預知性刺激引起的小鼠抑郁樣癥狀和改善Aβ42誘導的小鼠學習記憶損傷的作用。這些結果為治療抑郁癥和AD引起的抑郁癥狀和學習記憶障礙提供了新的治療靶點,有望通過抑制PDE4D4/5亞亞型來對抗抑郁癥狀和認知損傷。同時為闡明PDE4D亞亞型的情緒和認知調節(jié)作用提供了可靠的實驗依據(jù),也為開發(fā)PDE4亞型抑制劑提供了理論基礎。
【關鍵詞】：磷酸二酯酶4 PDE4DmiRNA 慢病毒 抑郁癥 認知障礙
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 第一部分 攜帶PDE4DmiRNA慢病毒載體的構建及鑒定13-27
• 前言13-16
• 實驗材料和方法16-22
• 實驗結果22-24
• 討論24-27
• 第二部分 慢病毒介導的PDE4DmiRNA對慢性不可預知性溫和刺激誘導的小鼠抑郁癥狀的調節(jié)作用27-47
• 前言27-29
• 實驗材料和方法29-34
• 實驗結果34-42
• 討論42-47
• 第三部分 慢病毒介導的PDE4DmiRNA對小鼠學習記憶障礙的改善作用及其機制研究47-72
• 前言47-49
• 第一節(jié) 慢病毒介導的PDE4DmiRNA對正常小鼠學習記憶能力的調節(jié)作用49-56
• 實驗材料和方法49-51
• 實驗結果51-56
• 第二節(jié) 慢病毒介導的PDE4DmiRNA對Aβ_(42)誘導的小鼠學習記憶損傷的調節(jié)及其機制研究56-66
• 實驗材料和方法56-59
• 實驗結果59-66
• 討論66-72
• 全文討論72-78
• 結論78-79
• 參考文獻79-91
• 綜述91-100
• 參考文獻97-100
• 攻讀學位期間發(fā)表論文100-101
• 英文縮略詞表101-102
• 致謝102-104
• 附件104

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本文編號：630484