本文關(guān)鍵詞：HO-1在軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用研究

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【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以進行性記憶和認(rèn)知功能減退為主要表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn),AD病人腦中中、長鏈和極長鏈脂肪酸水平增加,提示飽和脂肪酸可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激是AD的重要致病機制。軟脂酸(C16)等飽和脂肪酸可通過多種機制促進活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,誘發(fā)氧化應(yīng)激,在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此,利用抗氧化劑減少氧化應(yīng)激引起的腦損傷,有可能成為防治AD的重要靶點。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是腦內(nèi)的抗氧化酶之一,可通過其代謝產(chǎn)物(膽紅素等)清除活性氧,減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞造成的損傷。HO-1基因上游有抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)。核轉(zhuǎn)錄因子NRF2(Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2)是ARE的激活因子。正常情況下,NRF2位于胞漿,當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,NRF2在ERK等激酶作用下發(fā)生磷酸化,轉(zhuǎn)入細(xì)胞核,啟動HO-1的轉(zhuǎn)錄。AD病人腦中HO-1表達有增加。提示,HO-1可能通過代償性表達增加,提高腦的抗氧化能力,來抵御AD的病理進程。本實驗擬以軟脂酸C16作為刺激因素,以神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞為研究對象,在細(xì)胞水平研究在飽和脂肪酸誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下,HO-1的上調(diào)機制及其抗氧化作用,為尋找AD的防治靶點提供理論和實驗依據(jù)。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-M17細(xì)胞。2 ROS含量測定DHE染色法或化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞中ROS的含量。3實時定量RT-PCR檢測目的基因m RNA表達水平Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取2μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以18S r RNA做內(nèi)參,實時定量PCR測定HO-1和NRF2 m RNA的相對表達量。4 Western blot檢測目的基因蛋白表達水平提取神經(jīng)細(xì)胞總蛋白,Western blot測定HO-1、NRF2和ERK蛋白的相對表達量以及p-ERK的蛋白水平。5細(xì)胞免疫熒光染色檢測目的基因的定位或蛋白水平對神經(jīng)細(xì)胞進行免疫熒光染色,觀察細(xì)胞內(nèi)HO-1和NRF2的蛋白表達水平以及NRF2的入核情況。6數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理分析。數(shù)據(jù)以?x?SD表示,多組樣本之間兩兩比較用多個均數(shù)比較的方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:1軟脂酸(C16)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2 h,DHE染色法檢測細(xì)胞中的ROS水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,給予C16刺激后,細(xì)胞中的ROS呈劑量依賴性增加,并在200μM達到高峰。表明,軟脂酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激。2氧化應(yīng)激狀態(tài)下,神經(jīng)細(xì)胞中HO-1的表達代償性增加。給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2 h,實時定量RT-PCR檢測HO-1m RNA的表達,Western blot和細(xì)胞免疫熒光染色檢測HO-1的蛋白表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,給予C16刺激后,細(xì)胞中HO-1的m RNA和蛋白表達均呈劑量依賴性增加。表明,氧化應(yīng)激狀態(tài)下,HO-1的表達代償性增加。3 HO-1的表達上調(diào)可減輕軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。1)氧化應(yīng)激狀態(tài)下,ERK激酶被激活。給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2 h,Western blot檢測ERK激酶的表達及其磷酸化水平。結(jié)果顯示,給予C16刺激后,細(xì)胞中ERK的表達沒有明顯改變,但p-ERK的水平呈劑量依賴性增加。表明,氧化應(yīng)激狀態(tài)下,ERK激酶被激活。為了進一步明確ERK的活化與HO-1的表達之間的關(guān)系,將實驗分為四組:對照組,C16組,ERK抑制劑組和ERK抑制劑+C16組。Western blot檢測HO-1的表達和ERK的表達及其磷酸化水平。發(fā)現(xiàn),與對照組相比,單獨給予C16后,HO-1的表達和p-ERK的水平明顯升高;而同時給予C16和ERK抑制劑后,與單獨給予C16相比,HO-1的表達和p-ERK的水平明顯降低。ERK的表達各組沒有明顯差異。表明,HO-1的表達上調(diào)可能與ERK相關(guān)信號途徑的活化有關(guān)。2)氧化應(yīng)激狀態(tài)下,核轉(zhuǎn)錄因子NRF2被活化。給予細(xì)胞不同劑量的C16刺激2 h,細(xì)胞免疫熒光染色檢測ERK的底物,HO-1的上游調(diào)控因子NRF2的活性,即NRF2的入核情況。發(fā)現(xiàn),給予C16刺激后,細(xì)胞核中NRF2的水平明顯增加。同時,用實時定量RT-PCR和Western blot檢測NRF2的表達。結(jié)果顯示,與對照組相比,給予C16刺激后,NRF2的m RNA和蛋白表達均明顯增加。表明,HO-1的表達上調(diào)可能與ERK活化NRF2有關(guān)。3)HO-1的表達上調(diào)可減輕軟脂酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。實驗分為四組:對照組,NRF2激動劑組,C16組和NRF2激動劑+C16組。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,單獨給予C16或NRF2激動劑后,HO-1的表達升高,而同時給予C16和NRF2激動劑后,與單獨給予C16或NRF2激動劑相比,HO-1的表達升高更為明顯�；瘜W(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示,單獨給予C16刺激,與對照組相比,ROS的水平明顯增高;而同時給予C16和NRF2激動劑后,與單獨給予C16相比,ROS的水平明顯降低。表明,上調(diào)HO-1的表達可以減輕軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。結(jié)論:1軟脂酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激是AD的致病機制之一;2軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下,HO-1的代償性表達增加與ERK的激活,進而活化NRF2有關(guān);3上調(diào)HO-1的表達可以減輕軟脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 軟脂酸 氧化應(yīng)激 血紅素氧合酶-1 NF-E2相關(guān)因子2
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 英文縮寫12-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-25
• 附圖25-30
• 討論30-31
• 結(jié)論31
• 參考文獻31-33
• 綜述 飽和脂肪酸與阿爾茨海默病33-40
• 參考文獻36-40
• 致謝40-41
• 個人簡歷41

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本文編號：622023