本文關鍵詞：BACE1特異DNA適配子的篩選及其抑制BACE1作用的初步研究

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【摘要】：阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)是一種漸進性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以認知功能障礙尤其是記憶惡化為主要臨床表現(xiàn)。晚期病人生活不能自理,給患者家庭及社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔。由于人口老齡化和診斷率提高,AD患者的發(fā)病人數(shù)逐年增加,已成為日益嚴重的醫(yī)療保健問題。目前AD的發(fā)病機制尚不清楚,臨床上也尚無根治方法。當前常用的藥物乙酰膽堿酯酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑只能用于對癥治療。淀粉樣斑塊(amyloid plaques)是AD的主要病理學特征,其主要由淀粉樣蛋白(amyloid β, Aβ)組成。Ap是導致AD發(fā)病的重要因素。Ap由p-分泌酶及γ-分泌酶依次水解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)產(chǎn)生。由于γ-分泌酶有多個不同水解位點,可產(chǎn)生多種不同氨基酸長度的Ap肽。其中Aβ40、Aβ42是兩種主要的Ap單體。各種Ap單體和它們組成的低聚物、纖維狀物在腦內(nèi)異常聚集、沉積,引起神經(jīng)毒性。預防和減少過多的Ap產(chǎn)生是AD治療中的主要策略。p-淀粉樣前體蛋白裂解酶1 (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1),也稱β-分泌酶1 (β-secretase 1),是最主要的p-分泌酶,是Ap產(chǎn)生過程中的限速酶。抑制BACE1的表達或活性將從根本上減少Ap產(chǎn)生。已發(fā)現(xiàn)在AD病人尸檢腦組織中,BACE1的表達和活性增高。在有前驅(qū)癥狀的AD病人腦脊液中BACE1的水平也出現(xiàn)增高的現(xiàn)象。在具有APP Swedish突變基因(APPsw)的病人中,APP對BACE1的結(jié)合親和力增加,因而導致Ap產(chǎn)量增加。臨近BACE1水解位點的APP基因中的一個編碼突變(A673T)可減少BACE1對APP的裂解,具有預防AD的作用,為阻斷BACE1水解APP可對抗AD的理論提供了進一步的證據(jù)。一些研究也有力地證明了抑制BACE1活性可減輕小鼠腦內(nèi)的Aβ負荷。因此BACE1是治療AD的良好靶標。目前,BACE1抑制劑的開發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn),尚沒有安全有效的BACE1抑制劑應用于臨床。適配子(aptamer)是能形成特定的三維空間結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(單鏈DNA或RNA分子),能以高親和力和高特異性結(jié)合靶分子。與傳統(tǒng)的抗體相比,適配子有如下特征：分子量小,可在體外快速且重復合成,易于化學修飾；穩(wěn)定性好便于長期儲存；毒性低,免疫原性小；快速良好的組織滲透性。這些優(yōu)點使得適配子可代替抗體作為分子探針在基礎研究和臨床應用中發(fā)揮作用。適配子可通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)篩選得到。SELEX技術(shù)篩選步驟主要包括：首先將體外構(gòu)建的庫容量約為1013-1015的隨機寡核苷酸文庫與靶分子孵育；然后分離寡核苷酸-靶標復合物與未結(jié)合的寡核苷酸；再進行PCR擴增結(jié)合的寡核苷酸序列。經(jīng)過數(shù)輪或數(shù)十輪重復篩選,逐漸富集到特異結(jié)合靶分子的寡核苷酸序列。純化蛋白質(zhì)是最常用的SELEX篩選的靶標。以蛋白質(zhì)為靶標篩選出的適配子,可高效特異地抑制靶蛋白及用于核酸-蛋白質(zhì)作用機制的研究。本研究利用SELEX技術(shù),以純化的人BACE1蛋白胞外段作為靶分子,從體外合成的含30個核苷酸(nucleotides, nt)隨機片段的ssDNA文庫中篩選出以高親和力特異結(jié)合BACE1的適配子。利用基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)的間接ELISA法和pull-down實驗來測定適配子對BACE1的結(jié)合親和力及特異性。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)實驗以檢測適配子對BACE1體外活性的抑制作用。將適配子作用于M17-APPsw細胞(一種AD細胞模型),進行雙抗夾心ELISA和western blot實驗,檢測適配子對AD細胞模型中BACE1活性的抑制效應。首先,體外構(gòu)建合成兩端為固定序列、中間為30 nt的隨機序列、全長為73nt的ssDNA文庫(Gp30)。以純化的人BACE1蛋白胞外段為靶標,在微孔板上進行篩選。每一輪篩選過程主要包括ssDNA文庫與BACE1孵育結(jié)合、洗滌分離未結(jié)合的寡核苷酸序列、不對稱PCR擴增結(jié)合的寡核苷酸序列、切膠回收目的ssDNA得到次級文庫、再將次文庫與BACE1結(jié)合進行下一輪篩選等重復步驟。從第四輪篩選開始,亞文庫先與空白孔孵育進行反篩,以去除非特異結(jié)合的序列。共進行了七輪SELEX篩選。將第七輪得到的ssDNA進行克隆、測序。用Primer 5.0軟件分析測序結(jié)果,選擇兩端的固定序列與原庫相同、中間含有30 nt隨機片段的序列為目的序列,通過MEME在線軟件對所得序列進行同源性分析,用RNA STRUCTURE 5.5軟件測算二級結(jié)構(gòu)。共挑選出四個重復序列,命名為適配子A1、A2、A3、A4。其中序列A1的出現(xiàn)頻率最高。序列同源性分析未發(fā)現(xiàn)四個序列均共有的模序。二級結(jié)構(gòu)分析顯示四個序列均以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。為驗證適配子的靶蛋白及對靶蛋白的親和力,利用經(jīng)典的ELISA法及生物素-鏈親和素系統(tǒng)進行間接ELISA。將生物素標記的適配子呈兩倍濃度梯度稀釋,與BACE1孵育后再與辣根過氧化物酶標記的鏈親和素孵育,TMB顯色,測定450nm的吸光度值。將所測得的吸光度值與適配子的濃度通過Sigmaplot 12.0軟件進行非線性回歸分析得出解離常數(shù)(腸)值。用anti-BACE1抗體與BACE1孵育作為對照比較結(jié)合親和力；用無關適配子(U31)與BACE1孵育作為對照比較結(jié)合特異性。結(jié)果顯示適配子A1及A4的結(jié)合曲線擬合效果好,類似于BACE1抗體的擬合曲線(R值均達到0.99,P0.01)。而U31的結(jié)合曲線則不能擬合(P0.05)。適配子A1、A4對BACE1的結(jié)合親和力分別為68.5655±8.1237 nM、15.3497±2.0262 nM,與BACE1抗體對BACE1的親和力(2.7498±0.2785 nM)幾乎相近。說明A1及A4能以高親和力特異結(jié)合BACE1。利用鏈親和素磁珠-pull down實驗驗證適配子是否能結(jié)合AD細胞模型(M17-APPsw細胞)中的BACE1。選擇重復頻率最高的生物素標記的A1與鏈親和素磁珠孵育,再與M17-APPsw細胞蛋白提取液孵育。與適配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-適配子復合物上,經(jīng)洗滌后復合物通過SDS-PAGE膠分離,在PVDF膜上用BACE1抗體顯影。生物素標記的原文庫Gp30、U31及不加適配子組作為對照。結(jié)果顯示,A1組有明顯的70 KDa的BACE1蛋白條帶；Gp30組中70KDa處的條帶極細；U31及不加適配子組均未在70 KDa處顯現(xiàn)條帶。說明A1能特異結(jié)合M17-APPsw細胞中的BACE1蛋白。下一步進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗檢測A1是否能抑制BACE1的體外活性。BACE1底物兩端分別連接一個熒光供體和猝滅受體,隨著供體能量轉(zhuǎn)移至受體,供體發(fā)出的熒光可被受體所猝滅。BACE1裂解底物時,由于不能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移,來自于供體的熒光不能被猝滅,熒光信號增加。當加入抑制劑時由于底物裂解被抑制,熒光信號減低。利用這一原理,將不同濃度的適配子A1加入BACE1及其熒光底物的混合物中,檢測熒光強度的變化。BACE1的一種特異抑制劑、Gp30及U31作為對照。隨著濃度增加,標準抑制劑組中熒光值逐漸下降,至500nM時熒光值較陽性對照顯著減低(P0.01)。A1組在250 nM的終濃度時熒光值急速下降(P0.01)。Gp30及U31組熒光值無顯著減低。按抑制率(%)=100-(IFi/IF0×100)算出對BACE1活性的抑制率(IFi為加入測試物后的熒光值,IFo為不加測試物即陽性對照的熒光值)。將抑制率與測試物濃度的對數(shù)值進行線性回歸分析,擬合曲線,估算出A1的半數(shù)抑制濃度(IC50)為139.81 nM,小于標準抑制劑的IC50(242.50 nM)。說明A1對BACE1體外活性的抑制作用強。接著將不同濃度(200nM-10μM)的A1加入M17-APPsw細胞中培養(yǎng)24 h后進行MTT實驗以檢測A1對細胞存活率的影響。結(jié)果顯示A1終濃度在不超過3μM的范圍內(nèi)M17-APPsw細胞存活率不受影響。不同濃度(0.1 μM-3μM)A1處理M17-APPsw細胞24 h后收集細胞蛋白提取液,進行雙抗夾心ELISA法檢測Aβ40及Aβ42含量。在A1終濃度為3 μM時,細胞內(nèi)Aβ40及Aβ42濃度較空白組(未予任何處理組)均有顯著下降(P0.01)。因此用3 μM的A1作用于細胞后,收集細胞蛋白提取液及培養(yǎng)基進行雙抗夾心ELISA檢測。3 μM的Gp30、U31處理組和空白組作為對照。結(jié)果顯示M17-APPsw的細胞內(nèi)分泌的Aβ40及培養(yǎng)基中分泌的Aβ40濃度均較對照組顯著下降(P0.01)。同樣,M17-APPwt的細胞內(nèi)Aβ40及培養(yǎng)基中Aβ40濃度均較對照組顯著下降(P0.01)。與Aβ40類似,M17-APPsw的細胞Aβ42及細胞培養(yǎng)基中Aβ42濃度均較對照組顯著下降(P0.01)。為檢測A1對AD細胞模型中sAPPβ蛋白表達的影響,對A1、Gp30及U31處理后的M17-APPsw細胞裂解物進行western blot實驗。孵育的一抗分別為針對APP氨基端的APP抗體及anti-BACE1抗體。結(jié)果顯示A1組的sAPPβ蛋白表達水平較各對照組顯著下降(尸0.01、P0.05),各組間sAPPa及BACE1的表達量無明顯差異。上述結(jié)果提示A1能抑制AD細胞模型中BACE1活性。本研究通過SELEX技術(shù)成功篩選得到能以高親和力結(jié)合BACE1的DNA適配子,并證明該適配子具有抑制BACE1體外活性的作用。為新的強效特異的BACE1抑制劑的開發(fā)提供了研究基礎,為AD治療提供了新的方法和思路。
【關鍵詞】：指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化 DNA適配子 淀粉樣蛋白 β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1抑制劑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 前言17-24
• 材料與方法24-39
• 1 實驗材料24-28
• 2 實驗方法28-38
• 3 統(tǒng)計學分析38-39
• 實驗結(jié)果39-54
• 1 SELEX篩選目的ssDNA39-41
• 2 克隆測序后得到的重復序列41-43
• 3 間接ELISA法測定適配子對BACE1的親和力43-44
• 4 Pull-down實驗確定適配子結(jié)合的靶蛋白44-45
• 5 FRET法測定適配子抑制BACE1活性45-48
• 6 MTT實驗檢測適配子對細胞存活率的影響48
• 7 雙抗夾心ELISA法測定適配子對細胞內(nèi)A β產(chǎn)量的影響48-52
• 8 Western blot實驗檢測適配子對細胞內(nèi)sAPPα、sAPP β水平的影響52-54
• 討論54-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻58-68
• 綜述68-75
• 參考文獻72-75
• 論文發(fā)表情況75-76
• 致謝76-78

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 高海飛;牛彥;許鳳榮;梁磊;周博;李勇劍;王超;劉鵬;徐萍;;苯甲脒類BACE1抑制劑的設計和合成(英文)[J];Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences;2012年02期

2 ;[J];;年期

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1 梁惠玉;BACE1特異DNA適配子的篩選及其抑制BACE1作用的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

2 劉悅;糖尿病認知功能障礙患者血液硫化氫、BACE1和Aβ42變化的初步研究[D];重慶醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：558952