本文關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌Nodulisporium sp.次生代謝物對不同條件下Aβ42聚集過程的影響研究

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默病 Aβ42寡聚體 大分子聚集物 內(nèi)生真菌 次生代謝物

【摘要】：阿爾茨海默病是一種神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說,其中淀粉樣級聯(lián)學(xué)說是主流學(xué)說之一。根據(jù)淀粉樣級聯(lián)學(xué)說,跨膜前體蛋白經(jīng)剪切可形成含有38~43個氨基酸的淀粉樣β蛋白(Aβ)。當(dāng)Aβ42濃度達(dá)到一定程度時,聚集形成寡聚體以及纖維,引起神經(jīng)突觸損傷和炎癥發(fā)生,導(dǎo)致阿爾茨海默病。其中,Aβ42聚集形成的寡聚體是引起神經(jīng)細(xì)胞毒性的首要原因。因此,抑制Aβ42寡聚體形成或清除Aβ42寡聚體進(jìn)而阻止其神經(jīng)細(xì)胞毒性,對預(yù)防與干預(yù)阿爾茨海默病具有重要意義。本實驗利用硫磺素-T(Th T)熒光法、SDS-PAGE、原子力顯微鏡(AFM)掃描等方法對Aβ42聚集過程進(jìn)行研究,可以看到Aβ42在25℃的10m M PBS(p H=7.4)溶液的寡聚化條件下主要形成二聚體、四聚體、高聚體,而在37℃的10m M HCl(p H2.0)溶液的纖維化條件下可迅速形成纖維,且隨時間增加而延長。其中,Th T方法的突出優(yōu)點是方便、快捷、且靈敏度高,常常被用于從化合物庫中高通量篩選可抑制Aβ42聚集的活性化合物。但Th T熒光法并不能區(qū)分出Aβ42聚集混合物中的單體、二聚體、四聚體和高分子量寡聚體及Aβ42纖維。SDS-PAGE可有效分離和顯示Aβ42形成的各種聚集體,而且可定量分析各種聚集體的變化,是對Th T熒光法的重要補(bǔ)充。AFM方法可測定Aβ42聚集形成的不同顆粒的數(shù)量、高度和二維直徑與面積,并且與SDS-PAGE電泳中的不同條帶之間形成對應(yīng)關(guān)系。本文分析了三種實驗方法及其結(jié)果,綜合反映出Aβ42蛋白聚集過程的變化趨勢、各種寡聚體和聚集物的數(shù)量及其顆粒的形態(tài)變化等,為在體外研究Aβ42聚集形成規(guī)律提供了方法。在前期研究中,我們通過Th T熒光法從內(nèi)生真菌Nodulisporium sp.(No.65-17-2-1)的次生代謝產(chǎn)物篩選出兩種結(jié)構(gòu)相似的類黃酮化合物---Demethoxyviridin(Dmv)和Inoterpene B(Inp B),測定Dmv抑制Aβ42聚集活性,其IC50為13.4μM,表明Dmv可能具有抑制Aβ42聚集的活性。本文進(jìn)一步采用SDS-PAGE和AFM觀察方法,研究Dmv和Inp B對Aβ42寡聚化過程的影響。加入Dmv后,可明顯降低Aβ42在25℃的PBS溶液聚集過程中的Th T熒光值;SDS-PAGE電泳顯示Aβ42單體、二聚體、四聚體和高聚體明顯減少,而上樣孔內(nèi)出現(xiàn)更多的不能進(jìn)入濃縮膠的染色物質(zhì);同時,AFM測定顆粒高度大于8nm的無定形大分子聚集物顯著增多。而與僅含Aβ42的溶液相比較,Inp B對Aβ42的寡聚化過程幾乎沒有影響。因此,Dmv在25℃的PBS中促進(jìn)二聚體、四聚體和高聚體進(jìn)一步快速聚集成無定形的大分子聚集物。我們進(jìn)一步研究了Dmv和Inp B對Aβ42纖維化過程的影響。當(dāng)加入不同濃度Dmv后,可明顯降低Aβ42在HCl溶液聚集過程中的Th T熒光值;SDS-PAGE電泳顯示Aβ42單體、二聚體和四聚體明顯減少,高聚體有所增多,而上樣孔內(nèi)染色物質(zhì)的數(shù)量沒有增加;AFM觀察到Aβ42纖維的數(shù)量和長度都沒有明顯的改變。當(dāng)將HCl溶液替換為37℃的純水(p H=7)后,Dmv也可明顯降低Aβ42聚集過程的Th T熒光值;SDS-PAGE顯示Aβ42單體、二聚體和四聚體明顯減少直至基本消失,高聚體先增加后減少,上樣孔內(nèi)染色物質(zhì)的數(shù)量逐漸增加;AFM可以觀察到Aβ42形成了短纖維和大分子聚集物。因此,Dmv在37℃的純水中可促進(jìn)Aβ42寡聚體形成短纖維和大分子聚集物。綜上所述,Dmv可促進(jìn)Aβ42寡聚體形成大分子聚集物或短纖維,減少具有神經(jīng)細(xì)胞毒性的寡聚體,從而可能發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,為阿爾茨海默病干預(yù)和預(yù)防研究提供潛在的候選化合物。
【關(guān)鍵詞】：阿爾茨海默病 Aβ42寡聚體 大分子聚集物 內(nèi)生真菌 次生代謝物
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 緒論11-22
• 1.1 阿爾茨海默病11-12
• 1.2 β-淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說12-14
• 1.2.1 Aβ 多肽的來源12-13
• 1.2.2 Aβ 多肽的聚集13-14
• 1.2.3 Aβ 聚集物的細(xì)胞毒性14
• 1.3 阿爾茨海默病藥物和活性化合物14-17
• 1.3.1 防治阿爾茨海默病的藥物15-16
• 1.3.2 陸地動植物和微生物代謝產(chǎn)物16-17
• 1.3.3 海洋動植物代謝產(chǎn)物17
• 1.4 Aβ 蛋白聚集研究方法17-20
• 1.4.1 ThT熒光分析法17-18
• 1.4.2 SDS-PAGE和免疫印跡法18-19
• 1.4.3 原子力顯微鏡觀察19-20
• 1.5 本文研究20-22
• 第2章 材料與方法22-28
• 2.1 材料22-25
• 2.1.1 天然活性化合物及其來源22
• 2.1.2 實驗試劑及常用溶液22-24
• 2.1.3 實驗儀器24-25
• 2.2 方法25-28
• 2.2.1 Aβ42 多肽在PBS溶液中的寡聚化處理25
• 2.2.2 Aβ42 多肽在HCl溶液中的纖維化處理25
• 2.2.3 ThT熒光分析25-26
• 2.2.4 SDS-PAGE26
• 2.2.5 Western-Blotting26
• 2.2.6 Dot-Blotting26-27
• 2.2.7 原子力顯微鏡掃描觀察27-28
• 第3章 結(jié)果與分析28-47
• 3.1 Aβ42 的寡聚化和纖維化過程28-34
• 3.1.1 Aβ42 在PBS溶液中ThT熒光變化28
• 3.1.2 Aβ42 在PBS溶液中聚集的電泳結(jié)果28-29
• 3.1.3 Aβ42 在PBS溶液中形成的聚集物被抗體識別結(jié)果29-30
• 3.1.4 Aβ42 在PBS溶液中聚集的AFM觀察30-31
• 3.1.5 Aβ42 在HCl溶液中ThT熒光變化31-32
• 3.1.6 Aβ42 在HCl溶液中聚集的電泳結(jié)果32-33
• 3.1.7 Aβ42 在HCl溶液中聚集的AFM觀察33-34
• 3.2 化合物對Aβ42 寡聚化的影響34-40
• 3.2.1 化合物對Aβ42 寡聚化過程Th T熒光的影響34-35
• 3.2.2 化合物對Aβ42 寡聚化影響的電泳結(jié)果35-38
• 3.2.3 化合物對Aβ42 寡聚化影響的AFM觀察結(jié)果38-40
• 3.3 化合物對Aβ42 纖維化的影響40-47
• 3.3.1 化合物對Aβ42 在HCl溶液中聚集過程ThT熒光的影響40-41
• 3.3.2 化合物對Aβ42 在HCl溶液中聚集影響的電泳結(jié)果41-42
• 3.3.3 化合物對 Aβ42 在 HCl 溶液中聚集影響的 AFM 結(jié)果42-43
• 3.3.4 化合物對 Aβ42 在純水中聚集過程 ThT 熒光的影響43-44
• 3.3.5 化合物對Aβ42 在純水中聚集影響的電泳結(jié)果44-45
• 3.3.6 化合物對Aβ42 在純水中聚集影響的AFM結(jié)果45-47
• 第4章 討論47-51
• 4.1 Aβ42 在 PBS 溶液中聚集形成二聚體、四聚體和高聚體47-48
• 4.2 Aβ42 在 HCl 溶液中聚集形成纖維48
• 4.3 Dmv促進(jìn)Aβ42 寡聚體形成無定形大分子聚集物48-49
• 4.4 三種研究方法綜合反映Aβ42 聚集變化過程49
• 4.5 Dmv在HCl中不影響Aβ42 纖維形成49-50
• 4.6 Dmv促進(jìn)Aβ42 在純水中形成短纖維和大分子聚集物50-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 附錄60-61
• 致謝61-62
• 在校期間公開發(fā)表論文及著作情況62-63
• 在校期間參加科研項目情況63-64

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：539202