本文關(guān)鍵詞：晚期糖化終產(chǎn)物受體介導(dǎo)β-淀粉樣蛋白損傷血腦屏障的機(jī)制及銀杏葉提取物對(duì)其干預(yù)研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)退行性疾病,是癡呆的最常見類型。β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide, Aβ)沉積在腦實(shí)質(zhì)引起CNS損傷是AD的特征性病理改變。越來越多的研究表明,除引起CNS損傷外,Aβ沉積在腦微血管壁引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)功能障礙也是AD的重要病理改變,然而AD中BBB損傷的機(jī)制尚不清楚。研究認(rèn)為Ap沉積在腦血管系統(tǒng),破壞BBB結(jié)構(gòu)完整性,BBB屏障功能損傷及腦血流(cerebral blood flow, CBF)減少,腦組織氧和營養(yǎng)不足,腦內(nèi)毒性代謝產(chǎn)物堆積,從而加速AD病變進(jìn)展。鑒于BBB在AD發(fā)病中的重要作用,本課題擬從BBB病變?nèi)胧?研究Ap損傷BBB的可能機(jī)制,并通過觀察銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba, EGb)對(duì)該損傷途徑的干預(yù)影響,以期為探索AD的防治手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。BBB是機(jī)體的重要屏障之一,對(duì)維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證大腦正常功能極為重要。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC)是BBB的基本骨架,具有區(qū)別于外周血管內(nèi)皮的獨(dú)有特征。在高度分化的神經(jīng)血管系統(tǒng)中,BMEC以其顯著的特異性在BBB屏障特性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能中發(fā)揮著重要作用。BBB屏障功能及其低滲性主要依賴于內(nèi)皮間緊密連接(tight junction, TJ),后者是BBB屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),在保持內(nèi)皮生理屏障和低通透性方面具有關(guān)鍵作用。因此各種原因引起的TJ破壞都將導(dǎo)致BBB損傷,繼而CNS內(nèi)環(huán)境紊亂,最終加速中樞病變進(jìn)展。TJ主要由相關(guān)鉸鏈蛋白ZO (ZO-1、2、3)、 Claudin (Claudin-1、3、5、12)、Occludin構(gòu)成。BBB結(jié)構(gòu)完整性與TJ正常組合開放及關(guān)閉有關(guān),TJ蛋白表達(dá)減少或蛋白分布異常均能引起TJ結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致BBB結(jié)構(gòu)完整性破壞,BBB通透性增加。尸檢研究證實(shí)AD患者存在BBB結(jié)構(gòu)完整性受損,TJ蛋白水平顯著減少。在體動(dòng)物及體外細(xì)胞研究也發(fā)現(xiàn)Ap可引起TJ蛋白水平下降,BBB通透性增加。晚期糖化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)是晚期糖化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products, AGEs)的一種特征性細(xì)胞表面受體,屬于免疫球蛋白超家族成員。健康成人中,除在肺組織以外,RAGE僅有極微量表達(dá)。RAGE除與AGEs結(jié)合外,還能與高速泳動(dòng)族盒蛋白-1 (high mobility group box 1, HMGB-1)、S100/鈣粒蛋白家族、Aβ等多種配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)。近年研究發(fā)現(xiàn),在CNS, Aβ通過RAGE下游信號(hào)通路激活氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等損傷途徑,從而活化小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥效應(yīng),損傷神經(jīng)元。Aβ-RAGE相互作用還能激活核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB),引起RAGE表達(dá)增加,從而激活A(yù)8介導(dǎo)的正反饋損傷效應(yīng)。可見,腦內(nèi)RAGE表達(dá)上調(diào)與AD神經(jīng)元損傷相關(guān)。此外,BMEC上極微量表達(dá)的RAGE是參與BBB轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ的重要載體之一,其與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1 (LDH receptor related protein, LRP-1)協(xié)同維持腦內(nèi)Ap正常水平。LRP-1將腦內(nèi)Ap轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血液循環(huán),繼而經(jīng)肝臟代謝清除,RAGE則將血液中Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)入腦沉積。在AD中,LRP-1表達(dá)減少,RAGE含量顯著增加。然而,RAGE在AD BBB損傷中的作用仍不十分清楚。據(jù)此,本研究提出猜想,RAGE是否也與Ap誘導(dǎo)BBB損傷過程有關(guān),其相關(guān)調(diào)控機(jī)制如何?研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與多種病變引起的BBB通透性增加有關(guān),而抑制MMP活性能阻斷BBB損傷途徑。如腦卒中動(dòng)物模型ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平降低,敲除MMP-9能改善上述TJ蛋白水平。置于脈沖電磁場(pulsed electromagnetic field, PEMF)中的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)增加,ZO-1水平明顯減少,BBB通透性增加,而抑制MMP-2、MMP-9活性可阻斷PEMF引起的BBB損傷。據(jù)此我們推測,AD中BBB損傷可能與Aβ誘導(dǎo)MMP表達(dá)有關(guān),后者通過酶降解作用引起TJ蛋白含量減少,引起TJ正常結(jié)構(gòu)破壞及BBB通透性增加。AD屬于中醫(yī)“神病”、“健忘”等范疇。課題組在前期研究基礎(chǔ)上提出痰和瘀在AD發(fā)病中具有重要作用,并指出化瘀法是中藥防治AD的重要原則之一。課題組前期研究還發(fā)現(xiàn),EGb能改善改善老年患者認(rèn)知功能,患者簡易精神狀態(tài)檢查量表(mine-mental state examination, MMSE)、畫鐘試驗(yàn)(clock drawing, CD)、記憶商及短時(shí)記憶分值都顯著增加。EGb是中藥銀杏的干燥葉提取物,具有活血化瘀通絡(luò)之功效,是目前臨床防治AD的常用藥物之一。EGb能改善老年癡呆患者學(xué)習(xí)記憶功能,并具有清除活性氧自由基、改善線粒體功能、抑制Aβ神經(jīng)毒性等作用。最近一項(xiàng)關(guān)于EGb對(duì)BMEC保護(hù)作用的研究發(fā)現(xiàn),EGb能顯著改善氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)誘導(dǎo)的BMEC細(xì)胞活力下降,并能抑制OGD誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)。據(jù)此本研究觀察了EGb對(duì)Aβ誘導(dǎo)BBB損傷的影響,并探索其機(jī)制是否可能與EGb抑制RAGE表達(dá)有關(guān)。因此,本課題采用小鼠BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細(xì)胞模型,觀察Aβ1-42對(duì)BBB的影響并探討RAGE在Aβ1-42介導(dǎo)BBB損傷中的作用及其可能機(jī)制,同時(shí)觀察EGb對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)BBB損傷的干預(yù)作用。本課題主要結(jié)果如下：(一)RAGE介導(dǎo)Aβ1-42損傷BBB的機(jī)制研究1.Ap1-42誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷Apl-42誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷：MTT結(jié)果顯示Ap1-42降低BMEC細(xì)胞活力。三種形態(tài)Aβ1-42中,Aβ1-42單體(Aβ1-42-monomer, Aβ1-42-Mono)、寡聚態(tài)Aβ1-42 (Aβ1-42-oligomer, Aβ1-42-Oligo)及纖維狀A(yù)β1-42 (Aβ1-42-fibrils, Aβ1-42-Fibril)均能降低BMEC細(xì)胞活力。Aβ1-42-Oligo細(xì)胞毒性較Aβ1-42-Mono與Aβ1-42-Fibril顯著,Aβ1-42-Oligo呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞活力下降。2.Aβ1-42誘導(dǎo)BBB細(xì)胞模型通透性增加Ap1-42誘導(dǎo)BBB模型通透性增加：通過BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細(xì)胞模式,檢測熒光素鈉(sodium fluorescein, Na-F, MW: 376 Da)吸光值分析BBB細(xì)胞模型通透性變化,結(jié)果顯示三種成分Ap1-42均可誘導(dǎo)BBB模型通透性增加,Aβ1-42-Mono組Na-F吸光值為對(duì)照組的4.3倍,Aβ1-42-Oligo組Na-F吸光值為對(duì)照組的8.2倍,Aβ1-42-Fibril組Na-F吸光值為對(duì)照組的1.7倍；Aβ1-42-Oligo呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo)單細(xì)胞層BBB模型通透性增加。3.Aβ1-42誘導(dǎo)TJ蛋白水平下降1)Aβ1-42誘導(dǎo)ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平下降：Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,Aβ1-42-Oligo及Aβ1-42-Fibril均能不同程度降低ZO-1、Claudin-5、Occludin水平,其中與Aβ1-42-Mono和Aβ1-42-Fibril相比,Aβ1-42-Oligo的作用最顯著。2) Aβ1-42-Olig時(shí)間和濃度依賴性誘導(dǎo)ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平下降：Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,Aβ1-42-Oligo時(shí)間依賴性和濃度依賴性降低ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平。4.Aβ1-42誘導(dǎo)RAGE表達(dá)增加1)Aβ1-42上調(diào)RAGE蛋白水平：Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,Aβ1-42-Mono、Aβ1-42-Oligo及Aβ1-42-Fib均能不同程度誘導(dǎo)BBB內(nèi)皮細(xì)胞RAGE蛋白水平增加,其中Aβ1-42-Olig的作用最顯著。2) Aβ1-42-Oligo時(shí)間和濃度依賴性上調(diào)RAGE蛋白水平：Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示,Aβ1-42-Oligo時(shí)間依賴性和濃度依賴性上調(diào)RAGE蛋白水平。3) Aβ1-42-Oligo上調(diào)RAGE mRNA表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示,Aβ1-42-Olig上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)。5.Aβ1-42誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9表達(dá)增加1) Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9蛋白水平增加：Western Blot免疫印跡顯示,Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白水平增加。2) Aβ1-42-Oligo上調(diào)MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)：RT-PCR結(jié)果顯示,Aβ1-42-Oligo上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)。6.抑制RAGE活性阻斷TJ蛋白水平下降及RAGE、MMP-2與MMP-9表達(dá)1)抑制RAGE活性阻斷Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的RAGE表達(dá)及TJ蛋白水平減少：Western Blot免疫印跡顯示,中和抗體neutralizing anti-RAGE對(duì)ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白水平無影響,但能抑制Aβ1-42-Oligo引起的ZO-1、Claudin-5、Occludin水平降低及RAGE表達(dá)增加。2)抑制RAGE活性阻斷Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的MMP-2、MMP-9表達(dá)：WesternBlot免疫印跡顯示,中和抗體neutralizing anti-RAGE對(duì)MMP-2、MMP-9表達(dá)無影響,Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9蛋白水平增加效應(yīng)被中和抗體neutralizing anti-RAGE阻斷。(二) EGb干預(yù)Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BBB損傷的研究1.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷EGb改善BMEC細(xì)胞活力：通過MTT檢測細(xì)胞活力,結(jié)果顯示,EGb濃度依賴性抑制Aβ1-42-Oligo引起的BMEC細(xì)胞活力的降低,EGb濃度為100μg/ml時(shí)BMEC細(xì)胞活力為對(duì)照組的97.01%,EGb濃度200 μg/ml時(shí)BMEC細(xì)胞活力為對(duì)照組的95.13%。2.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞凋亡EGb抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生：Hoechst-33258染色顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生,降低Aβ1-42-Oligo引起的BMEC細(xì)胞凋亡比例。3.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞內(nèi)ROS生成EGb抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成：H2DCF-DA熒光染色檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BMEC胞內(nèi)ROS生成。4.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BBB細(xì)胞模型通透性增加EGb抑制ApM2-Oligo誘導(dǎo)的BBB通透性增加：Na-F檢測單細(xì)胞層BBB模型通透性結(jié)果顯示,EGb濃度依賴性抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BBB通透性增加。5.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)TJ蛋白水平降低EGb改善ZO-K Claudin-5、Occludin蛋白水平Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示EGb濃度依賴性抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BMEC上ZO-1、Claudin-5、 Occludin蛋白水平降低。6.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)RAGE水平增加EGb抑制RAGE蛋白水平增加Western Blot免疫印跡,結(jié)果顯示EGb濃度依賴性抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BMEC上RAGE水平增加。結(jié)論：1)Aβ能引起B(yǎng)BB細(xì)胞模型通透性增加,Aβ-Oligo可能是AD中引起該損傷效應(yīng)的主要Ap成分。2) RAGE是介導(dǎo)Aβ?lián)p傷BBB的重要環(huán)節(jié),Aβ-RAGE相互作用引起TJ蛋白損傷,BBB細(xì)胞模型通透性增加,其機(jī)制與誘導(dǎo)BMEC損傷及上調(diào)MMP-2、MMP-9及RAGE自身表達(dá)增加相關(guān)。3)EGb對(duì)Aβ誘導(dǎo)BBB損傷具有保護(hù)作用,能保護(hù)TJ蛋白,降低BBB細(xì)胞模型通透性,其機(jī)制與抑制Aβ毒性誘導(dǎo)BMEC損傷及抑制RAGE表達(dá)相關(guān)。通過比較三種不同成分Aβ對(duì)BBB的影響,本研究首次闡述AP1-42-Oligo可能是AD中引起B(yǎng)BB損傷的主要因素,并揭示RAGE是Aβl-42誘導(dǎo)BBB損傷過程的重要環(huán)節(jié),其機(jī)制與RAGE介導(dǎo)Aβ細(xì)胞毒性,激活RAGE下游信號(hào)途徑,引起MMP-2與MMP-9表達(dá)相關(guān)。本研究首次闡明EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BBB損傷,其保護(hù)機(jī)制與EGb改善細(xì)胞活力、抑制細(xì)胞凋亡與內(nèi)源性ROS生成,以及抑制RAGE表達(dá)有關(guān)。本研究為探討RAGE作為AD的治療靶點(diǎn),以及EGb防治AD的機(jī)制研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：晚期糖化終產(chǎn)物受體 血腦屏障 β-淀粉樣蛋白 銀杏葉提取物 阿爾茨海默病
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R749.16
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-14
• Abstract14-20
• 前言20-24
• 第一部分 RAGE通過誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9表達(dá)介導(dǎo)Aβ?lián)p傷血腦屏障24-40
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法24-33
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料24-26
• 1.1. 主要試劑24-25
• 1.2. 主要儀器25
• 1.3. 溶液配制25-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-33
• 2.1. BMEC細(xì)胞培養(yǎng)與處理26-27
• 2.1.1. BMEC細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)26-27
• 2.1.2. BMEC細(xì)胞處理27
• 2.2. Aβ_(1-42)的制備27
• 2.3. MTT測定BMEC細(xì)胞活力27-28
• 2.4. Na-F滲漏試驗(yàn)評(píng)估BBB通透性28-29
• 2.4.1. Assay Buffer28
• 2.4.2. BBB模型通透性檢測28-29
• 2.5. Western Blot免疫印跡29-30
• 2.5.1. 細(xì)胞總蛋白提取與蛋白變性處理29
• 2.5.2. Western Blot免疫印跡檢測蛋白含量29-30
• 2.6. RT-PCR30-32
• 2.6.1. 細(xì)胞總RNA提取30-31
• 2.6.2. RT-PCR反應(yīng)體系31-32
• 2.6.3. 瓊脂糖凝膠電泳32
• 2.7. 統(tǒng)計(jì)分析32-33
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-39
• 3.1. Aβ_(1-42)誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷33
• 3.2. Aβ_(1-42)誘導(dǎo)BBB細(xì)胞模型通透性增加33-34
• 3.3. Aβ_(1-42)誘導(dǎo)TJ蛋白水平下降34-35
• 3.4. Aβ_(1-42)誘導(dǎo)RAGE表達(dá)增加35-37
• 3.5. Aβ_(1-42)誘導(dǎo)MMP-2、MMP-9表達(dá)增加37-38
• 3.6. 抑制RAGE活性阻斷Aβ_(1-42)誘導(dǎo)TJ損傷及RAGE、MMP-2與MMP-9表達(dá)38-39
• 小結(jié)39-40
• 第二部分 EGb通過抑制Aβ_(1-42)-Oligo細(xì)胞毒性及RAGE表達(dá)保護(hù)血腦屏障40-51
• 實(shí)驗(yàn)材料與方法40-45
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 1.1. 主要試劑40
• 1.2. 主要儀器40-41
• 1.3. 溶液配制41-42
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法42-45
• 2.1. BMEC細(xì)胞培養(yǎng)與處理42
• 2.1.1. BMEC細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)42
• 2.1.2. BMEC細(xì)胞處理42
• 2.2. Aβ_(1-42)-Oligomer的制備42
• 2.3. EGb處理細(xì)胞42-43
• 2.4. MTT檢測BMEC細(xì)胞活力43
• 2.5. Na-F滲漏試驗(yàn)檢測BBB通透性43
• 2.6. Hoechst-33258檢測細(xì)胞凋亡43-44
• 2.7. 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測44
• 2.8. Western Blot免疫印跡44
• 2.8.1. 細(xì)胞總蛋白提取與蛋白變性處理44
• 2.8.2. Western Blot免疫印跡檢測蛋白含量44
• 2.9. 統(tǒng)計(jì)分析44-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-50
• 3.1. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷45-46
• 3.2. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞凋亡46
• 3.3. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞內(nèi)ROS生成46-47
• 3.4. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)BBB細(xì)胞模型通透性增加47-48
• 3.5. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)TJ蛋白水平下降48-49
• 3.6. EGb抑制Aβ_(1-42)-Oligo誘導(dǎo)RAGE蛋白水平增加49-50
• 小結(jié)50-51
• 討論51-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 綜述 晚期糖化終產(chǎn)物受體：β-淀粉樣蛋白損傷血腦屏障的干預(yù)新靶點(diǎn)62-74
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 附錄74-76
• 在校期間發(fā)表論文74-75
• 在校期間獲獎(jiǎng)情況75
• 參與基金情況75-76
• 致謝76-77

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7 計(jì)學(xué)理 ,尉繼偉 ,吉U，

本文編號(hào)：533943