額顳葉癡呆（FTD）是繼阿爾茨海默病之后,第二大常見的癡呆癥。部分FTD具有與17號染色體連鎖關系,命名為FTDP-17。FTDP-17是位于染色體17q21.31上的MAPT基因突變所致。至今,在家族性額顳葉癡呆病例中,已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MAPT基因中大約有80個致病性錯義突變,大多落在Tau蛋白結合微管的編碼區(qū)。Tau蛋白是微管相關蛋白,在神經(jīng)元細胞內主要協(xié)助微管組裝,但病變的Tau蛋白卻會從微管上脫落,異常聚集,形成誘導神經(jīng)元死亡的病理產物。目前,在阿爾茨海默病中Tau蛋白研究熱點主要集中于過度磷酸導致的相關病理機制,而很少涉及Tau蛋白的基因突變。有報道稱,FTDP-17中的Tau基因突變同樣可形成類似于阿爾茨海默癥患者大腦中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)纖維纏結（NFT）。所以,從Tau蛋白基因突變入手,特別是微管結合區(qū)域的突變,研究不同突變對Tau蛋白纖維化和微管組裝功能的影響是一條新的途徑。本研究課題選取的是FTDP-17臨床上已發(fā)現(xiàn)的5種Tau突變:K257T、N279K、P301L、K317M和V337M,它們位于Tau結合微管的重復區(qū)域（R1-R4）。以Tau k18片段為材料,首先通過對Ta... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 Tau蛋白相關的神經(jīng)退行性疾病
        1.1.1 Tau蛋白與阿爾茨海默癥
        1.1.2 Tau蛋白與FTDP-
        1.1.3 其他Tau蛋白相關疾病
    1.2 Tau蛋白
        1.2.1 Tau蛋白的結構
        1.2.2 Tau蛋白的生理功能
        1.2.3 Tau蛋白的異常修飾
        1.2.4 基因突變對Tau蛋白功能的影響
    1.3 Tau蛋白的纖維化研究
        1.3.1 Tau蛋白的纖維化過程
        1.3.2 Tau蛋白纖維的核心結構
        1.3.3 肝素與Tau蛋白的纖維化
    1.4 微管蛋白與微管的組裝
        1.4.1 Tubulin的結構
        1.4.2 微管的組裝
        1.4.3 Tau蛋白與Tubulin的相互作用
    1.5 分子模擬技術的應用及研究進展
        1.5.1 分子模擬技術的簡介
        1.5.2 分子模擬在生命科學研究中的應用
    1.6 本工作的研究目的和主要研究內容
        1.6.1 研究目的及意義
        1.6.2 研究內容
第二章 Tau蛋白基因定點突變及表達純化
    2.1 材料與儀器
        2.1.1 質粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 儀器
        2.1.4 試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 Tau蛋白基因的定點突變
        2.2.2 Tau突變型質粒的擴增與鑒定
        2.2.3 目的基因的轉導與菌體的保種
        2.2.4 Tauk18蛋白的表達
        2.2.5 Tauk18蛋白的純化
    2.3 實驗結果及分析
        2.3.1 PCR定點突變的結果
        2.3.2 表達條件探索結果
        2.3.3 樣品不同前處理方法比較
        2.3.4 HPLC法對蛋白純化的結果
    2.4 討論
第三章 突變型Tau蛋白對自身纖維化的影響
    3.1 材料與儀器
        3.1.1 蛋白
        3.1.2 試劑
        3.1.3 儀器
        3.1.4 試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Tau蛋白自身纖維化模型的構建
        3.2.2 不同突變型Tau蛋白自身纖維化動力學比較
        3.2.3 Tauk18蛋白纖維化產物的電泳鑒別
        3.2.4 透射電鏡觀察不同突變型Tau蛋白纖維的結構
        3.2.5 不同pH值對Tauk18自身纖維化的影響
        3.2.6 DTT對Tau蛋白自身纖維化的影響
    3.3 實驗結果及分析
        3.3.1 不同濃度的肝素鈉對Tauk18自身纖維化的動力學影響
        3.3.2 Tauk18蛋白BCA定量結果
        3.3.3 不同突變型Tauk18蛋白纖維化動力學比較結果
        3.3.4 取樣不同Tauk18蛋白單體與纖維的電泳結果
        3.3.5 透射電鏡拍攝不同突變型Tauk18蛋白纖維的結果
        3.3.6 不同pH值對Tauk18自身纖維化的影響
        3.3.7 DTT對Tau蛋白自身纖維化的影響
    3.4 討論
第四章 突變型Tau蛋白對微管組裝動力學的影響
    4.1 材料與儀器
        4.1.1 蛋白
        4.1.2 試劑
        4.1.3 儀器
        4.1.4 試劑配制
    4.2 實驗方法
        4.2.1 微管組裝模型的建立
        4.2.2 不同突變型Tauk18蛋白對微管組裝動力學的影響
        4.2.3 電泳鑒別微管組裝反應產物
    4.3 實驗結果及分析
        4.3.1 微管組裝模型的建立
        4.3.2 不同突變型Tauk18蛋白對微管組裝動力學影響
        4.3.3 電泳鑒別微管組裝反應產物
    4.4 討論
第五章 Tau蛋白與Tubulin結合的分子動力學模擬
    5.1 材料與儀器
        5.1.1 模擬體系
        5.1.2 分子動力學模擬運行的服務器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 Tauk18同源建模
        5.2.2 Tubulin同源建模
        5.2.3 Tauk18與Tubulin的分子對接與分子動力學模擬
        5.2.4 Tauk18與Tubulin結合的自由能計算
    5.3 實驗結果及分析
        5.3.1 Tauk18同源建模的結果
        5.3.2 Tubulin同源建模的結果
        5.3.3 Tauk18與Tubulin分子對接的模型
        5.3.4 Tauk18與Tubulin的結合自由能
        5.3.5 Tubulin-Tau(K257T)復合物的分子動力學模擬
        5.3.6 Tubulin-Tau(N279K)復合物的分子動力學模擬
        5.3.7 Tubulin-Tau(P301L)復合物的分子動力學模擬
        5.3.8 Tubulin-Tau(K317M)復合物的分子動力學模擬
        5.3.9 Tubulin-Tau(V337M)復合物的分子動力學模擬
    5.4 討論
結論
參考文獻
附錄A Tauk18及突變型的氨基酸序列
附錄B Tubulin單體的氨基酸序列
致謝
攻讀碩士學位期間研究成果



本文編號：3683665