甲基苯丙胺（methamphetamine,MA）濫用在我國乃至世界范圍內(nèi)增長迅猛。.相比于海洛因、可卡因等傳統(tǒng)毒品,MA的成癮性更強、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害更嚴重,但對MA成癮的研究較為滯后,國內(nèi)外尚無批準的治療藥物。藥物成癮是從偶然用藥、規(guī)律性用藥轉(zhuǎn)變?yōu)閺娖刃杂盟幍倪B續(xù)過程,其中強迫性用藥是成癮的核心特征。目前研究認為這一轉(zhuǎn)換的行為學基礎(chǔ)是由目標導(dǎo)向性逐漸向習慣化過渡,涉及到的核團主要是.以伏隔核（nucleus accumbens,NAc）為核心的腹側(cè)紋狀體（ventral striatum,vStr）對行為的控制逐漸讓位于背側(cè)紋狀體（dorsalstriatum,dStr）特別是背外側(cè)紋狀體（dorsolateralstriatum,dlStr）,然而其中的細胞分子基礎(chǔ)尚不清楚。因此,研究規(guī)律性用藥轉(zhuǎn)化為強迫性用藥的細胞及分子機制是闡明MA成癮機制的關(guān)鍵。.微小RNA（microRNA,miRNA）是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的非編碼RNA。研究表明miRNA表達異常與可卡因、阿片和酒精成癮有關(guān),但關(guān)于miRNA與MA成癮的報道較少,尤其是與強迫性用藥相關(guān)的研究基本處于空白。本課題... 

【文章來源】：軍事科學院北京市

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【學位級別】：博士

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縮略語表
摘要
Abstract
前言
第一章 大鼠背外側(cè)紋狀體miR-30a對甲基苯丙胺成癮行為的調(diào)節(jié)作用
    第一節(jié) miR-30a與大鼠甲基苯丙胺強迫性用藥行為的相關(guān)性
        1. 研究背景
        2. 材料和方法
            2.1 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠主動給藥和被動給藥模型的建立
                2.1.1 建立甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥模型
                2.1.2 建立甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠被動給藥模型
                2.1.3 取材
            2.2 實時熒光定量PCR檢測紋狀體各亞區(qū)miR-30a的表達變化規(guī)律
                2.2.1 miRNA的提取
                2.2.2 miRNA經(jīng)莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA
                2.2.3 實時定量PCR擴增
            2.3 LV-miR-30a病毒包裝與整體動物水平驗證
                2.3.1 LV-miR-30a慢病毒的制備
                2.3.2 實時熒光定量PCR檢測LV-miR-30a在整體動物水平的有效性
                2.3.4 免疫熒光實驗觀察LV-miR-30a的表達
            2.4 miR-30a對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
                2.4.1 大鼠頸靜脈插管以及腦立體定位注射病毒手術(shù)
                2.4.2 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥訓(xùn)練
                2.4.3 實時熒光定量PCR檢測紋狀體中miR-30a的表達變化
        3. 結(jié)果
            3.1 甲基苯丙胺誘導(dǎo)miR-30a的差異表達特征
                3.1.1 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠規(guī)律性用藥和強迫性用藥模型
                3.1.2 主動給藥模型下紋狀體各亞區(qū)miR-30a的表達變化規(guī)律
                3.1.3 被動給藥模型下紋狀體各亞區(qū)miR-30a的表達變化規(guī)律
            3.2 LV-miR-30a在dIStr中選擇性上調(diào)miR-30a表達
            3.3 上調(diào)dlStr miR-30a表達水平降低甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠強迫性用藥行為
        4. 討論
        5. 小結(jié)
    第二節(jié) dlStr miR-30a參與甲基苯丙胺強迫性用藥的機制研究
        1. 研究背景
        2. 材料和方法
            2.1 miR-30a的預(yù)測靶基因及生物信息學分析
                2.1.1 miRNA預(yù)測靶基因的獲取
                2.1.2 生物信息學分析
            2.2 雙熒光素酶報告基因驗證miR-30a與預(yù)測靶基因的靶向關(guān)系
                2.2.1 構(gòu)建BDNF基因3'-UTR雙熒光素酶報告載體
                2.2.2 Luciferase熒光測定
            2.3 主動給藥模型中miR-30a靶基因的差異表達
                2.3.1 RT-qPCR檢測miR-30a靶基因mRNA水平的表達
                2.3.2 WB檢測miR-30a靶基因蛋白水平的表達
            2.4 獲得有效的LV-sh-Tnrc6a病毒
                2.4.1 在細胞水平篩選下調(diào)Tnrc6a的shRNA序列
                2.4.2 整體動物水平驗證LV-sh-Tnrc6a的有效性
            2.5 Tnrc6a對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
                2.5.1 大鼠頸靜脈插管以及腦立體定位注射病毒手術(shù)
                2.5.2 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥訓(xùn)練
                2.5.3 Western Blot檢測大鼠dlStr中Tnrc6a的表達變化
            2.6 獲得有效的LV-sh-BDNF病毒
                2.6.1 在細胞水平篩選下調(diào)BDNF的shRNA序列
                2.6.2 整體動物水平驗證LV-sh-BDNF的有效性
            2.7 BDNF對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
                2.7.1 大鼠頸靜脈插管以及腦立體定位注射病毒手術(shù)
                2.7.2 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥訓(xùn)練
                2.7.3 Western Blot檢測大鼠dIStr中BDNF的表達變化
            2.8 主動給藥模型中BDNF下游通路關(guān)鍵分子的表達變化
                2.8.1 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥模型的建立
                2.8.2 Western Blot檢測紋狀體中BDNF下游通路中關(guān)鍵分子的表達變化
            2.9 BDNF下游通路對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
                2.9.1 溶液配制
                2.9.2 大鼠頸靜脈插管以及腦立體定位埋管手術(shù)
                2.9.3 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠長時程自身給藥訓(xùn)練
        3. 結(jié)果
            3.1 miR-30a靶基因預(yù)測及驗證
                3.1.1 miR-30a預(yù)測靶基因的生物信息學分析
                3.1.2 雙熒光素酶報告基因驗證miR-30a的預(yù)測靶分子
            3.2 甲基苯丙胺誘導(dǎo)miR-30a靶分子的差異表達特征
            3.3 miR-30a靶分子Tnrc6a與甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的相關(guān)性
                3.3.1 LV-sh-Tnrc6a在dIStr中選擇性下調(diào)Tnrc6a表達
                3.3.2下調(diào)dlStr Tnrc6a表達水平不影響甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠強迫性用藥行為
            3.4 miR-30a靶分子BDNF與甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的相關(guān)性
                3.4.1 LV-sh-BDNF在dlStr中選擇性下調(diào)BDNF表達
                3.4.2 下調(diào)dlStr BDNF表達水平能降低甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠強迫性用藥行為
            3.5 BDNF下游通路對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
                3.5.1 規(guī)律性用藥及強迫性用藥模型下BDNF下游通路關(guān)鍵分子的差異表達特征
                3.5.2 ERK通路抑制劑U0126不影響甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為
                3.5.3 PI3K通路抑制劑LY294002能降低甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為
        4. 討論
        5. 小結(jié)
    第三節(jié) miR-30a與線索誘發(fā)的大鼠復(fù)吸行為的相關(guān)性
        1. 研究背景
        2. 材料和方法
            2.1 miR-30a及靶分子BDNF在線索誘發(fā)的大鼠復(fù)吸模型中的表達變化
                2.1.1 建立甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠復(fù)吸模型
                2.1.2 RT-qPCR檢測dlStr中miR-30a及其靶分子BDNF的表達變化
        3. 結(jié)果
            3.1 大鼠復(fù)吸傾向與miR-30a及其靶分子BDNF表達水平的相關(guān)性
        4. 討論
        5. 小結(jié)
第二章 大鼠背外側(cè)紋狀體miR-134對甲基苯丙胺成癮行為的調(diào)節(jié)作用
    1. 研究背景
    2. 材料和方法
        2.1 主動給藥和被動給藥模型中miR-134及其靶分子LIMK1的差異表達
            2.1.1 RT-qPCR檢測miR-134及其靶分子LIMK1 mRNA水平的表達變化
            2.1.2 Western Blot檢測LIMK1蛋白水平的表達變化
        2.2 雙熒光素酶報告基因驗證miR-134海綿體的有效性
            2.2.1 LIMK1 基因 3’-UTR 雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建
            2.1.2 Luciferase熒光測定
        2.3 免疫熒光觀察LV-miR-134-sil病毒的表達
        2.4 下調(diào)dlStr miR-134對甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥行為的影響
            2.4.1 甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠自身給藥模型的建立
            2.4.2 RT-qPCR檢測dlStr中miR-134的表達變化
            2.4.2 Western Blot檢測dlStr中LIMK1的表達變化
    3. 結(jié)果
        3.1 甲基苯丙胺誘導(dǎo)miR-134及其靶分子LIMK1的差異表達特征
            3.1.1 甲基苯丙胺強迫性用藥大鼠dIStr中miR-134表達上調(diào)其靶分子LIMK1表達下調(diào)
            3.1.2 甲基苯丙胺被動給藥不改變大鼠dlStr miR-134及其靶分子LIMK1的表達
        3.2 干預(yù)miR-134表達水平對甲基丙胺自身給藥行為的影響
            3.2.1 miR-134海綿體功能性下調(diào)miR-134的表達
            3.2.2 下調(diào)dIStr miR-134表達水平降低甲基苯丙胺誘發(fā)的大鼠強迫性用藥行為
    4. 討論
    5. 小結(jié)
第三章 結(jié)論與展望
參考文獻
作者在學期間取得的學術(shù)成果
在讀期間發(fā)表的代表性論著
主要簡歷
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]MicroRNAs of microglia: wrestling with central nervous system disease[J]. Xiao-Hua Wang,Tian-Long Wang.  Neural Regeneration Research. 2018(12)
[2]甲基苯丙胺誘導(dǎo)大鼠不可控制性自身給藥行為模型的建立[J]. 陳瑛,曹丹旎,金雪峰,吳寧,宋睿,李錦.  國際藥學研究雜志. 2013(03)

博士論文
[1]超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子（HCN）通道對甲基苯丙胺成癮的調(diào)節(jié)作用及機制研究[D]. 曹丹旎.中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院 2016



本文編號：3204463