β淀粉樣蛋白（amyloidβpeptide,Aβ）是治療阿爾茲海默氏病的關(guān)鍵靶標(biāo)之一。目前免疫治療使用的免疫原Aβ主要通過化學(xué)方法合成,生產(chǎn)成本高且免疫性弱,不能滿足科研和醫(yī)療對免疫原的需求�；蚬こ碳夹g(shù)為高免疫性Aβ的大量生物合成提供了有效途徑。本文構(gòu)建了Aβ串聯(lián)基因的真核及原核表達(dá)載體,研究了Aβ基因在大腸桿菌的表達(dá)并獲得了轉(zhuǎn)基因煙草,為利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)Aβ疫苗奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)人類Aβ基因序列及重疊PCR技術(shù)原理設(shè)計(jì)引物,通過PCR擴(kuò)增獲得2個Aβ基因串聯(lián)的DNA片段（2Aβ）;將此片段克隆到載體pGEX-6P-1（GST）中,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-Aβ;將此載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá);利用GST抗體進(jìn)行的Western雜交檢測結(jié)果顯示,GST/Aβ融合蛋白能在大腸桿菌中表達(dá),但表達(dá)量低而且有降解。為提高外源基因在植物中的表達(dá)水平,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含雙CaMV35S啟動子及TEV增強(qiáng)子的植物表達(dá)載體pBIDST（d35S-tev/gus）;轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果初步表明,d35S-tev驅(qū)動的gus基因的表達(dá)水平高于CaMV35S... 

【文章來源】：大連理工大學(xué)遼寧省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 阿爾茨海默病簡介
    1.2 Aβ在阿爾茨海默病中的作用
        1.2.1 Aβ的分子結(jié)構(gòu)特征及產(chǎn)生
        1.2.2 Aβ的神經(jīng)毒性
        1.2.3 Aβ與炎癥反應(yīng)
    1.3 以Aβ為靶標(biāo)治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展
        1.3.1 抑制Aβ產(chǎn)生和沉積
        1.3.2 抗氧化作用
        1.3.3 抗炎癥治療
        1.3.4 Aβ免疫治療
    1.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究進(jìn)展
        1.4.1 轉(zhuǎn)基因植物疫苗的特點(diǎn)
        1.4.2 轉(zhuǎn)基因植物疫苗存在的問題及解決方案
        1.4.3 Aβ植物疫苗的研究現(xiàn)狀
    1.5 本研究的目的和意義
2 β淀粉樣蛋白基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 質(zhì)粒DNA的小量提取
        2.2.2 重疊PCR法克隆Aβ串聯(lián)基因
        2.2.3 原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-Aβ的構(gòu)建
        2.2.4 Aβ串聯(lián)基因在E.coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 2Aβ基因片段的克隆
        2.3.2 原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-Aβ的構(gòu)建
        2.3.3 2Aβ蛋白表達(dá)
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 含雙35S啟動子和TEV增強(qiáng)子的植物表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 載體pBIDST的構(gòu)建
        3.2.2 工程菌的獲得
        3.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化
        3.2.4 轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測
        3.2.5 GUS組織化學(xué)染色
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 載體pBIDST的構(gòu)建
        3.3.2 轉(zhuǎn)基因抗性煙草的獲得
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色檢測
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 Aβ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 2Aβ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 煙草轉(zhuǎn)化及抗性芽篩選
        4.2.3 抗性植株P(guān)CR檢測
        4.2.4 煙草葉片RNA提取
        4.2.5 抗性植株RT-PCR檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 2Aβ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得
        4.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測
        4.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR檢測
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3191025