本文關(guān)鍵詞：單細胞海藻提取物對hUC-MSCs移植治療AD鼠的抗衰老作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種漸進性的學習記憶功能喪失及空間認知功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,同時伴隨有人格和行為的改變,并且也是與年齡密切相關(guān)的老年性疾病,亦稱老年癡呆。隨著人口老齡化日益加重,AD的發(fā)病率逐年上升,研究結(jié)果表明衰老是AD發(fā)病的重要影響因素之一。研究AD的發(fā)病機制和尋求理想的治療藥物和手段仍是當今世界醫(yī)學的難題。干細胞移植作為一種新的治療方法為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了希望。人臍帶間充質(zhì)干細胞具有自我更新和多向分化的潛能。因h UC-MSCs取材方便、來源廣泛,低免疫源性,并且體外易于分離培養(yǎng),因此h UC-MSCs成為組織工程及細胞替代治療的種子細胞。近年來研究報道顯示,國內(nèi)外研究者通過干細胞治療各種疾病的臨床療效觀察其治療疾病的效果取得了較好的進展。但是,研究發(fā)現(xiàn)干細胞在體外培養(yǎng)過程中與其他正常細胞一樣,隨著傳代次數(shù)的增加,細胞在不僅形態(tài)上表現(xiàn)出衰老特征,而且增殖活性和分化能力減弱,細胞發(fā)生衰老。由于干細胞活力降低從而不能夠維持機體正常的組織更新,引發(fā)機體的衰老甚至導致相關(guān)疾病的發(fā)生。因此,尋找調(diào)控干細胞增殖和抗衰老的關(guān)鍵因子對于提高干細胞生物學活性和治療效果至關(guān)重要。海洋單細胞海藻(marine phytoplankton,MPPT)是一種無毒害,純天然提取的海洋生物產(chǎn)品。MPPT因其成分齊全,營養(yǎng)豐富,富含不飽和脂肪酸、有機元素、礦物質(zhì)和維他命等,所以具有抗病毒、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、提高免疫力和促進機體新陳代謝等生物學活性,是大自然的杰作。但是,MPPT對h UC-MSCs的抗衰老作用尚未見明確報道。因此,本研究通過體內(nèi)外實驗研究MPPT對h UC-MSCs的抗衰老作用。目的本研究擬通過體外實驗檢測MPPT對h UC-MSCs的抗衰老作用,通過體內(nèi)實驗研究MPPT對h UC-MSCs移植治療AD的抗衰老作用及其可能的分子機制。為提高干細胞治療效果和尋求新的AD防治策略提供科學依據(jù)和研究思路,具有重要的研究意義和應用價值。方法1體外實驗研究MPPT對h UC-MSCs衰老的影響取剖宮產(chǎn)健康新生兒臍帶,分離、傳代、培養(yǎng)h UC-MSCs,顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài),將h UC-MSCs培養(yǎng)至第3、10、15代,流式細胞儀檢測細胞表面標記CD45、CD90、CD44、CD34、CD29;收集第3、10、15代細胞,q RT-PCR檢測不同傳代細胞中p16、p21、p53、p CNA、sirt2、sirt1m RNA的表達。CCK-8法分析不同濃度的MPPT對h UC-MSCs生長增殖的影響,確定MPPT的最佳作用濃度;流式細胞術(shù)檢測1g/L的MPPT對h UC-MSCs細胞周期和細胞凋亡的影響;β-半乳糖苷酶染色法檢測1g/L的MPPT對h UC-MSCs衰老的調(diào)控;q RT-PCR檢測MPPT對h UC-MSCs中p16、p21、p53、p CNA、sirt2、sirt1m RNA表達的影響;Western Blot檢測MPPT對h UC-MSCs中衰老蛋白P16、P21、P53、PCNA、Sirt2、Sirt1的表達變化的影響。2體內(nèi)實驗研究MPPT單獨或聯(lián)合h UC-MSCs治療對AD的抗衰老作用取3月齡AD模型鼠(APP695v7171轉(zhuǎn)基因小鼠)60只,全為雄鼠,隨機分為6組:模型組(APP+組),MPPT組(每天200mg/kg給藥)、P3h UC-MSCs移植組(P3 h UC-MSCs組)、MPPT聯(lián)合P3h UC-MSCs移植組(MPPT+P3h UC-MSCs組)、P15h UC-MSCs移植組(P15 h UC-MSCs組)、MPPT聯(lián)合P15h UC-MSCs移植組(MPPT+P15h UC-MSCs組)以及1組10只遺傳背景相同的非轉(zhuǎn)基因鼠作為正常對照組(APP-組)。APP+組和APP-組均給予相同體積生理鹽水灌胃,干細胞移植組(5×105個),MPPT稀釋成相同體積藥液灌胃給藥,MPPT組和聯(lián)合給藥組每日1次,連續(xù)灌胃1個月(至4月齡),定期觀察小鼠的精神狀態(tài)、肢體活動狀況以及體重變化的情況。Morris水迷宮法檢測小鼠行為學的改變;水迷宮結(jié)束后宰殺小鼠,免疫組化法檢測小鼠腦組織中MAB1281的表達觀察h UC-MSCs的存活情況;提取小鼠血清,采用TBA法和羥胺法檢測小鼠血清中丙二醛(Malondialdehyd,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的含量變化;解剖取小鼠腦組織,q RT-PCR和Western Blot檢測腦組織中衰老相關(guān)基因p16、p21、p53、p CNA、sirt2、sirt1在m RNA和蛋白質(zhì)水平的表達變化。結(jié)果1、h UC-MSCs在P3代時呈梭形貼壁細胞,大小均勻一致。P10 h UC-MSCs細胞形態(tài)呈梭形與P3無明顯變化。P15 h UC-MSCs呈不規(guī)則狀態(tài),寬大扁平,易脫壁。P3、P10、P15 h UC-MSCs表面均表達CD44、CD90和CD29,不表達CD45和CD34;隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加,h UC-MSCs中p CNA、sirt2、sirt1m RNA相對表達量減少,而p16、p21、p53m RNA相對表達量增加。與P15組相比,1g/L的MPPT可促進P15 h UC-MSCs的增殖,促進細胞周期進入S期;MPPT處理組細胞的β-半乳糖苷酶陽性率明顯降低,細胞中p CNA、sirt2、sirt1m RNA和蛋白的表達量增加,而p16、p21、p53m RNA和蛋白的表達量降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、給藥期間,各組小鼠精神狀況良好,皮毛光澤無脫毛現(xiàn)象,活動正常,并未出現(xiàn)異常的行為學改變,如嗜睡、不安等;h UC-MSCs和MPPT均可以明顯改善小鼠的學習記憶功能,二者聯(lián)合時效果更佳(P0.05)。一月后小鼠腦組織中聯(lián)合治療組的h UC-MSCs存活率明顯多于單獨移植組。在體內(nèi)治療過程中,h UC-MSCs(5×105 cells)和MPPT(200 mg/kg)的不同治療模式的小鼠在SOD及MDA的改善方面,聯(lián)合治療組血清中SOD活性明顯上升,MDA含量明顯下降,具有著最佳的治療效果。在各治療組中腦組織中p16、p21、p53的表達明顯下降,而p CNA、sirt2、sirt1的表達則顯著上升;其中,聯(lián)合治療模式對于p16、p21和p53的抑制作用以及對p CNA、sirt2和sirt1的促進作用顯著優(yōu)于單一治療方法(P0.05)。結(jié)論1、MPPT通過調(diào)節(jié)h UC-MSCs中p16、p21、p53、p CNA、sirt2、sirt1等衰老相關(guān)基因的表達增強細胞活性、延緩干細胞衰老。2、MPPT促進h UC-MSCs的存活和調(diào)控衰老相關(guān)基因的表達提高h UC-MSCs移植治療AD鼠的抗衰老作用,而且MPPT和h UC-MSCs的聯(lián)合治療明顯優(yōu)于MPPT或h UC-MSCs單一治療效果。
【關(guān)鍵詞】：單細胞海藻提取物 人臍帶間充質(zhì)干細胞 阿爾茲海默病 抗衰老
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略詞13-15
• 引言15-18
• 第一部分 MPPT對hUC-MSCs的抗衰老作用及機制研究18-34
• 前言18-19
• 1 材料與方法19-27
• 2 結(jié)果27-31
• 3 討論31-33
• 4 小結(jié)33-34
• 第二部分 MPPT聯(lián)合hUC-MSCs對AD鼠的抗衰老作用研究34-48
• 前言34-35
• 1 材料與方法35-41
• 2 結(jié)果41-46
• 3 討論46-47
• 4 小結(jié)47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-53
• 綜述 干細胞的衰老調(diào)控機制53-63
• 參考文獻59-63
• 附錄63-65
• 個人簡歷65-66
• 致謝66

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：單細胞海藻提取物對hUC-MSCs移植治療AD鼠的抗衰老作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：292056