本文關(guān)鍵詞：Wnt2和Wnt3在慢性束縛應(yīng)激引起的抑郁行為中的作用及其機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：Wnt蛋白是分泌型糖蛋白,能夠激活不同的信號通路,包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路,非經(jīng)典的Wnt/PCP 和 Wnt/Ca2+通路。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號通路在胚胎發(fā)生和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用,如突觸發(fā)生,樹突形態(tài)構(gòu)建以及海馬等結(jié)構(gòu)的形成中。Wnt/β-catenin信號通路與成年海馬中的神經(jīng)再生也密切相關(guān)。而神經(jīng)再生在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展及治療中至關(guān)重要,提示W(wǎng)nt信號通路可能參與抑郁過程中。有文獻(xiàn)報道Wnt信號通路下游信號分子如GSK-3β等在抑郁癥的發(fā)病及其治療中發(fā)生明顯變化并參與其中。但是關(guān)于Wnt分子是否參與抑郁癥的發(fā)生的直接證據(jù)很少。應(yīng)激是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的一個重要因素。研究發(fā)現(xiàn)Wnt受體及其Wnt下游信號通路分子也參與到應(yīng)激過程中,例如慢性不可預(yù)見性應(yīng)激會使海馬中Wnt受體Frizzled 6 (Fzd6)表達(dá)減少；在慢性社交挫敗應(yīng)激的小鼠中,Wnt下游信號通路的關(guān)鍵性分子disheveled-2 (DVL2)在伏隔核部位表達(dá)下降。最近有報道發(fā)現(xiàn)急性和慢性應(yīng)激能夠增加Wnt信號通路下游的抑制分子Dickkopf-1 (Dkk-1)在海馬中的表達(dá)。以上都是基于對Wnt信號通路分子做的研究。但是,Wnt分子作為激活Wnt/β-catenin信號通路的配體是否直接參與到應(yīng)激中目前還不清楚。本課題中,我們采用慢性束縛應(yīng)激(CRS)模型,運用動物行為學(xué)測試和分子細(xì)胞生物學(xué)等方法,系統(tǒng)地研究是否有Wnt分子參與到CRS引起的抑郁行為中以及Wnt分子參與CRS引起的抑郁行為的具體機制。目的：1.探究有無Wnt分子參與CRS引起的抑郁行為。2.探究Wnt分子參與CRS引起的抑郁行為的機制。方法：1.慢性束縛應(yīng)激(CRS)小鼠每天從上午8點到10點在通風(fēng)聚丙烯束縛管中束縛應(yīng)激2小時,連續(xù)14天。2.腦立體定位和病毒微量注射小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后固定于腦立體定位儀上。選擇腹側(cè)海馬注射病毒,注射量為每側(cè)1微升,注射坐標(biāo)(以前囟點為零點)如下：前后,-2.8毫米；左右,±2.5毫米；背腹側(cè),-2.3毫米。3.行為學(xué)測試3.1曠場實驗本課題中利用曠場實驗測試小鼠的自主運動能力。小鼠被放進曠場中央?yún)^(qū),檢測10分鐘內(nèi)的運動總距離作為評價其自主運動能力的指標(biāo)。3.2蔗糖偏好實驗在CRS最后一天,從晚上8點開始對小鼠飲水進行控制。適應(yīng)階段小鼠只有在早上8點到9點可飲用1%的蔗糖水,適應(yīng)3天。測試階段在8點到9點分別給予小鼠一瓶1%的蔗糖水和一瓶水,測試時間為2天,檢測兩天內(nèi)蔗糖水和水的飲用量。蔗糖偏好指數(shù)表示為：蔗糖的攝入量／水和蔗糖攝入總量×100%。3.3強迫游泳實驗強迫游泳實驗是在一個玻璃容器中進行(25厘米高,直徑10厘米,水溫22度,水深18厘米),將小鼠放入容器中觀察6分鐘的不動時間。不動定義為身體靜止,只有尾巴或前爪小幅度的運動以保持頭部露出水面。3.4懸尾實驗將小鼠尾端懸掛在特定裝置上觀察6分鐘,記錄不動時間。4.BrdU注射和免疫組織化學(xué)染色對于細(xì)胞增殖的分析,小鼠腹腔注射50 mg/kg的溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)一次,2小時后灌注。對于神經(jīng)元存活的分析,小鼠每24小時給予一次共4次BrdU注射,4周后進行灌注。小鼠用5%的水合氯醛麻醉并用4%的多聚甲醛(PFA)灌注和后固定。腦片切成30微米用于免疫組織化學(xué)染色。BrdU的一抗使用濃度為1：500,NeuN的一抗使用濃度為1：1000。免疫組化染色的腦片用共聚焦顯微鏡拍照并用于BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計以及BrdU和NeuN雙陽性細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計。5.實時定量PCR實驗提取組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green熒光標(biāo)記法實時定量PCR檢測目的基因和內(nèi)參β-actin的mRNA表達(dá)水平。6.蛋白提取和蛋白印跡實驗小鼠腦組織樣品經(jīng)裂解液裂解后提取總蛋白并檢測蛋白濃度。樣品用蛋白印跡實驗進行檢測,用Quantity one軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：1.CRS能導(dǎo)致小鼠腹側(cè)海馬Wnt2和Wnt3表達(dá)的降低。為了研究Wnt分子在CRS中的作用,我們利用實時定量PCR和Westernblot的方法檢測在海馬腦區(qū)(背側(cè)海馬和腹側(cè)海馬)分布較多的Wnt分子的mRNA及蛋白的表達(dá)變化. Real-time PCR結(jié)果表明在6種Wnt分子中(Wnt2,Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt7a),只有Wnt2和Wnt3在腹側(cè)海馬是降低的,而在背側(cè)海馬這6種Wnt分子都沒有變化。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)果。Wnt2和Wnt3在腹側(cè)海馬的選擇性降低提示我們Wnt2和Wnt3可能參與到CRS引起的抑郁行為中。2.干擾腹側(cè)海馬中Wnt2或Wnt3的表達(dá)能夠模擬CRS引起的抑郁行為。我們用RNA干擾病毒干擾內(nèi)源性的Wnt2和Wnt3,檢測是否會導(dǎo)致抑郁行為發(fā)生。結(jié)果顯示,干擾Wnt2或Wnt3的小鼠表現(xiàn)出蔗糖偏好實驗中蔗糖攝入量的減少和強迫游泳實驗及懸尾實驗中不動時間的增加,能夠?qū)е乱钟粜袨榈陌l(fā)生。3.過表達(dá)Wnt2和Wnt3能夠緩解CRS引起的抑郁行為。我們運用過表達(dá)Wnt2和Wnt3的病毒研究Wnt2和Wnt3能否緩解應(yīng)激引起的抑郁行為。結(jié)果顯示過表達(dá)Wnt2和Wnt3后小鼠能夠逆轉(zhuǎn)CRS引起的蔗糖攝入量的減少以及在懸尾實驗和強迫游泳實驗中不動時間的增加。表明過表達(dá)Wnt2和Wnt3能夠緩解CRS引起的抑郁行為,而且同時過表達(dá)Wnt2和Wnt3比單獨過表達(dá)Wnt2或Wnt3抗抑郁效果更明顯。4. Wnt/β-catenin信號通路和神經(jīng)再生參與CRS引起的抑郁行為。我們發(fā)現(xiàn)CRS之后Wnt/β-catenin信號通路和神經(jīng)再生是降低的；干擾Wnt2或Wnt3之后,Wnt/β-catenin信號通路和神經(jīng)再生也是降低的；而過表達(dá)Wnt2和Wnt3之后,CRS引起的Wnt/β-catenin信號通路的損傷和神經(jīng)再生的損傷能夠被逆轉(zhuǎn)。這表明Wnt2和Wnt3通過Wnt/β-catenin信號通路和神經(jīng)再生參與到CRS引起的抑郁行為中。5.Wnt2和Wnt3能夠介導(dǎo)抗抑郁藥物的作用。我們發(fā)現(xiàn)Wnt2和Wnt3在抑郁行為中發(fā)揮了重要作用,那么Wnt2和Wnt3是否參與一些抗抑郁藥的作用過程?本課題中,我們選擇抗抑郁藥物——氟西汀作為研究。我們發(fā)現(xiàn)氟西汀腹腔注射2周可以緩解抑郁行為并能夠逆轉(zhuǎn)CRS引起的Wnt2和Wnt3的減少。用慢病毒干擾Wnt2或Wnt3后能夠減弱氟西汀的抗抑郁作用。結(jié)論：1.腹側(cè)海馬中Wnt2和Wnt3表達(dá)的降低參與到CRS引起的抑郁行為的發(fā)生。2.腹側(cè)海馬Wnt2和Wnt3通過Wnt/β-catenin信號通路和神經(jīng)再生的機制參與抑郁發(fā)生。3.腹側(cè)海馬Wnt2和Wnt3在氟西汀的抗抑郁作用中發(fā)揮重要作用。意義：本課題中,我們發(fā)現(xiàn)了Wnt分子參與CRS引起的抑郁行為的直接證據(jù),并闡明了其具體機制。為將來抑郁癥的治療提供了新思路和新方法。
【關(guān)鍵詞】：慢性束縛應(yīng)激 抑郁 腹側(cè)海馬 Wnt2 Wnt3
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符號說明16-18
• 前言18-20
• 材料與方法20-32
• 實驗結(jié)果32-52
• 討論52-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文62-63
• 附件63

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本文編號：288032