目的:GLP-1類似物對阿爾茨海默病樣神經(jīng)退行性變的神經(jīng)保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:1)采用處于對數(shù)生長期的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y共成6組:空白對照組即CON組,磷酸鹽緩沖液PBS處理12h;模型組即wortmannin干預(yù)組,1μmol/L wortmannin處理12h;藥物對照組即杜拉魯肽(D)或GLP-1(7-37)短肽(P)干預(yù)組,10nmol/L杜拉魯肽或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽處理12h;治療組即D+W或P+W組,分別由10nmol/L杜拉魯肽與1μmol/L wortmannin共同處理12h或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽與1μmol/L wortmannin共同處理12h;共同干預(yù)組即D+W+E組或P+W+E組,分別由10nmol/L杜拉魯肽、1μmol/L wortmannin與10μmol/L Ex9-39共同干預(yù)12h或50nmol/L GLP-1(7-37)短肽、1μmol/L wortmannin與10μmol/L Ex9-39共同干預(yù)12h;抑制劑組即E組,10μmol/L Ex9-39處理12h。MTT法檢測各組細(xì)胞活力,蛋白免疫印跡法檢測各組微管相關(guān)的Tau總蛋白、不同磷酸化位點(diǎn)蛋白質(zhì),神經(jīng)絲NFs磷酸化水平,胰島素信號通路PI3K-GSK3β和MAPK中關(guān)鍵酶的磷酸化水平。細(xì)胞免疫熒光檢測GLP-1信號的改變。2)取SPF級6周齡20只雄性野生型C57BL/6(WT)小鼠和40只APP/PS1/Tau三重轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠隨機(jī)地分成4組:野生組即WT組,野生型小鼠鼻腔給予生理鹽水治療;野生滴鼻GLP-1(7-37)組即WT+Du組,野生型小鼠鼻腔給予GLP-1(7-37)短肽治療;轉(zhuǎn)基因組即Tg組,轉(zhuǎn)基因小鼠鼻腔給予生理鹽水治療;轉(zhuǎn)基因給藥組即Tg+Du(N)組、Tg+Du(P)組和Tg+Ins(N)組,轉(zhuǎn)基因小鼠分別鼻腔給予GLP-1(7-37)短肽、皮下注射GLP-1(7-37)短肽和鼻腔給予胰島素混懸液。其中Tg+Du(P)組和Tg+Ins(N)組作為Tg+Du(N)組的陽性對照。各組小鼠每天早晚2次給藥,總共給予10μg GLP-1(7-37)短肽和0.4單位胰島素,WT組和Tg組則每天給予等體積的無菌生理鹽水,持續(xù)4周。每天監(jiān)測各組小鼠體重和血糖改變情況;Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力;蛋白免疫印跡法檢測小鼠腦組織中Tau蛋白和神經(jīng)絲蛋白(NFs)的磷酸化水平,胰島素下游信號通路PI3K-GSK3β以及MAPK關(guān)鍵酶的磷酸化水平。結(jié)果:1)與CON組細(xì)胞相比,模型組和抑制劑組細(xì)胞活力下降,Tau蛋白在絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)262、396和404位點(diǎn)以及NF-H/M的磷酸化水平升高,而杜拉魯肽和GLP-1(7-37)組處理的細(xì)胞活力上升,Tau各位點(diǎn)和NFs蛋白的磷酸化水平降低;與模型組的細(xì)胞相比,杜拉魯肽和GLP-1(7-37)治療后細(xì)胞活力上升,Tau各位點(diǎn)和NFs蛋白的磷酸化水平下降。但與治療組細(xì)胞相比,經(jīng)過Ex9-39共同干預(yù)后的細(xì)胞活力下降,Tau各位點(diǎn)和NFs蛋白磷酸化水平增高。與CON組細(xì)胞相比,模型組和抑制劑組細(xì)胞PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平和突觸蛋白水平降低,而杜拉魯肽和GLP-1(7-37)治療后細(xì)胞PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平和突觸蛋白水平升高;與模型組細(xì)胞相比,杜拉魯肽和GLP-1(7-37)處理的細(xì)胞PI3K-GSK3β和MAPK蛋白表達(dá)水平上升,經(jīng)過Ex9-39干預(yù)后,其蛋白磷酸化表達(dá)水平下降。2)除胰島素組外,各組小鼠體重和血糖變化無差異。與野生組小鼠相比,轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期和游泳路徑長度明顯延長,穿越隱匿平臺次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著縮短,小鼠腦內(nèi)Tau和NFs蛋白磷酸化修飾明顯增多,胰島素信號通路PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平顯著降低。而轉(zhuǎn)基因小鼠鼻腔給予GLP-1(7-37)短肽或胰島素,皮下給予GLP-1(7-37)短肽后轉(zhuǎn)基因小鼠逃避潛伏期和游泳路徑長度明顯縮短,穿越隱匿平臺次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著縮短,小鼠腦內(nèi)Tau和NFs蛋白磷酸化修飾明顯減少,胰島素信號通路PI3K-GSK3β和MAPK磷酸化水平顯著升高。結(jié)論:1)GLP-1類似物杜拉魯肽和GLP-1(7-37)短肽改善細(xì)胞活力,增加突觸蛋白表達(dá),減少Tau和NFs過度磷酸化的神經(jīng)保護(hù)作用可能與胰島素和GLP-1信號水平激活有關(guān);2)GLP-1(7-37)短肽鼻腔給藥提高AD小鼠認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶能力,降低小鼠腦內(nèi)Tau和NFs過度磷酸化的神經(jīng)保護(hù)作用可能與改善小鼠腦內(nèi)胰島素信號有關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

操作步驟：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y 貼壁生長于75ml培溫箱中孵育，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔 3 天更換一次培養(yǎng)液。時(shí)，凍存、傳代或用于實(shí)驗(yàn)。1.1.2.2 藥物的量效曲線和實(shí)驗(yàn)分組（1）藥物的量效曲線測定：①杜拉魯肽設(shè)定濃度與時(shí)間梯度：分別設(shè)置 0.5nmol/L、25nmol/L 和 50nmol/L 濃度梯度，分別作用于 0h、3h、6h②GLP-1(7-37)短肽設(shè)定濃度與時(shí)間梯度：分別設(shè)置 50500nmol/L、1μmol/L 和 3μmol/L 濃度梯度，分別作用于 ③wortmannin 設(shè)定濃度與時(shí)間梯度：wortmannin 分別設(shè)置和 10μmol/L 濃度梯度，分別作用于 0h、3h、6h、9h 和 ④Ex9-39 設(shè)定濃度與時(shí)間梯度：Ex9-39 分別設(shè)置 2μmol/L8μmol/L 和 10μmol/L 濃度梯度，分別作用于 0h、3h、6

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 二、GLP-1（7-37）短肽對 AD 小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制圖 2 各藥物濃度的量效曲線A.：杜拉魯肽的量效曲線；B：GLP-1(7-37)短肽的量效曲線；C：wortmannin 的量效曲線；D：Ex9-39 的量效曲線。（n=10）1.2.2 各組細(xì)胞活力分析采用 MTT 實(shí)驗(yàn)探究各組細(xì)胞的活力的變化及各藥物對細(xì)胞活力的影響。與CON 組細(xì)胞相比，W 組和 E 組細(xì)胞活力下降（P＜0.05），D 組與 P 組細(xì)胞活力上升（P＜0.05）；與 W 組細(xì)胞相比，D+W 組與 P+W 組細(xì)胞活力上升（P＜0.05）；分別與 D+W 組或 P+W 組細(xì)胞相比，對應(yīng) D+W+E 組或 P+W+E 組細(xì)胞活力下降（P＜0.05）。A B

圖 4 各組細(xì)胞 Tau 蛋白磷酸化水平的 Western blot 結(jié)果A：Tau 蛋白磷酸化水平的 Western blot 結(jié)果；B：杜拉魯肽處理的 Tau 蛋白各磷酸化位點(diǎn)定量分析統(tǒng)計(jì)圖；C：GLP-1（7-37）短肽 處理的 Tau 蛋白各磷酸化位點(diǎn)定量分析統(tǒng)計(jì)圖與 CON 組細(xì)胞比較，*P＜0.05，與 W 組細(xì)胞比較，#P＜0.05，與 D+W 或 P+W組比較，ΔP＜0.05。（n=3）1.2.4 NF-H/M 磷酸化水平比較R61d 抗體檢測細(xì)胞內(nèi) NFs 總 NF-H 重鏈和 NF-M 輕鏈蛋白變化，SMI31 抗體檢測細(xì)胞 NF-H 重鏈和 NF-M 輕鏈蛋白磷酸化水平。結(jié)果顯示，各組 NFs 未被磷酸化的總蛋白無明顯差異。與 CON 組細(xì)胞相比，W 組和 E 組細(xì)胞 NF-H/M磷酸化水平升高（P＜0.05），D 組和 P 組細(xì)胞 NF-H/M 磷酸化水平下降（P＜0.05）；與 W 組細(xì)胞相比，D+W 組和 P+W 組細(xì)胞 NF-H/M 磷酸化水平下降（P＜0.05）；與 D+W 組或 P+W 組細(xì)胞相比，D+W+E 組或 P+W+E 組細(xì)胞 NF-H/M 磷酸化水
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2855845