背景與目的 阿爾茨海默病是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β-淀粉樣蛋白是阿爾茨海默病特征性的病理改變老年斑的主要成分,已有研究表明阿爾茨海默病發(fā)病早期即存在Aβ蛋白的沉積,其沉積部位、面積和量與AD認(rèn)知功能障礙程度密切相關(guān)。量子點(diǎn)是一種新型的熒光分子探針,與傳統(tǒng)的熒光染料相比,具有熒光強(qiáng)度高、光學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)勢,將量子點(diǎn)與APP、Aβ蛋白特異結(jié)合,發(fā)展AD分子光學(xué)成像技術(shù),指導(dǎo)阿爾茨海默病的早期診斷具有廣闊的發(fā)展前景。本項(xiàng)目擬構(gòu)建pcDNA3.1/APP595/596并列突變質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人胚腎HEK293細(xì)胞,建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型;應(yīng)用量子點(diǎn)對APP、Aβ蛋白靶向標(biāo)記,并將其與傳統(tǒng)熒光染料對比,在評估量已點(diǎn)生物相容性的同時(shí),獲取量子點(diǎn)熒光成像強(qiáng)度和熒光穩(wěn)定性的相關(guān)資料,為量已點(diǎn)早期應(yīng)擴(kuò)于阿爾茨海默病的分子影像診斷打下基礎(chǔ)。 方法 1)對pcDNA3.1/APP質(zhì)粒(美國Pittsburgh大學(xué)的Perez博士惠贈(zèng))進(jìn)行測序,證實(shí)除質(zhì)粒本身第595和596位氨基酸密碼子存在并列突變外,序列的第4位堿基有意外突變(C→G),并影響到正常氨基酸的表達(dá),亮氨酸(Leu)變成了纈氨酸(Val)。因此實(shí)驗(yàn)擬行質(zhì)粒APPcDNA第4位堿基的定點(diǎn)突變。從原始質(zhì)�？寺∧０逯�,利用PCR方法擴(kuò)增目的基因APP695cDNA,將目的基因和目的載體pcDNA3.1分別酶切;純化酶切產(chǎn)物后定向連接,并將其轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,對長出的克隆行PCR鑒定,PCR鑒定為陽性的克隆送測序并行比對分析。2)將點(diǎn)突變后pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)株,細(xì)胞免疫熒光和Western-blot方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞APP的表達(dá)和Aβ蛋白生成情況。3)采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT分析法結(jié)合流式細(xì)胞檢測凋亡技術(shù),系統(tǒng)考察QDs-SA量子點(diǎn)(濃度2.5～25nm)對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞的毒性作用。4)應(yīng)用激光共聚焦熒光成像和流式細(xì)胞技術(shù),對QDs-SA量子點(diǎn)靶向標(biāo)記阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中APP、Aβ蛋白的熒光進(jìn)行檢測,同時(shí)與基于傳統(tǒng)熒光染料標(biāo)記的免疫熒光分析方法進(jìn)行比較。 結(jié)果 1)應(yīng)用DNAStar軟件對陽性克隆測序結(jié)果與GenBank中APP基因序列比對,證實(shí)原序列中的錯(cuò)義突變G已被突變回C,第4位點(diǎn)堿基定點(diǎn)突變完成,pcDNA3.1/APP595/596并列突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。2)Western-blot在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒的細(xì)胞中檢測到目的條帶,而轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞未見APP蛋白表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色后,共聚焦熒光顯微鏡下觀察APP基因轉(zhuǎn)染后能夠生成APP和Aβ蛋白,前者主要定位于細(xì)胞胞膜,Aβ蛋白主要表達(dá)于近膜胞漿,細(xì)胞膜上也有表達(dá)。3)在2.5～25nm濃度范圍內(nèi),與QDs-SA量子點(diǎn)共育24小時(shí)后,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯改變;MTT示量子點(diǎn)作用細(xì)胞吸光度值與對照組相比未見明顯差異;不同濃度量子點(diǎn)組間吸光度值比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。流式細(xì)胞檢測空白對照組與各濃度組間凋亡早期細(xì)胞百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。4)在波長為388nm紫外光激發(fā)下,QDs-SA量子點(diǎn)的最大熒光發(fā)射峰波長約為605±10nm,半峰寬小于35nm。激光共聚焦顯微鏡熒光分析示QDs-SA量子點(diǎn)標(biāo)記APP和Aβ蛋白相較于傳統(tǒng)Cy3熒光染料的平均熒光密度值更大(P＜0.05);488nm激發(fā)光連續(xù)激發(fā)12分鐘,QDs-SA量子點(diǎn)熒光標(biāo)記的APP和Aβ蛋白仍發(fā)射較強(qiáng)的橙紅色熒光,熒光強(qiáng)度分別下降了27.87%、29.25%,而傳統(tǒng)熒光染料Cy3熒光強(qiáng)度下降幅度高達(dá)79.60%和76.82%。流式細(xì)胞儀檢測QDs-SA量子點(diǎn)和Cy3活細(xì)胞標(biāo)記膜蛋白APP陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),QDs-SA量子點(diǎn)熒光標(biāo)記APP蛋白的流式熒光圖形呈寬端型,Cy3標(biāo)記的APP流式熒光圖形呈扁平形,平均熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論 1)成功構(gòu)建了在真核細(xì)胞中能高效表達(dá)人APP和Aβ蛋白的真核表達(dá)載體,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型。2)在一定的濃度范圍內(nèi),QDs-SA量子點(diǎn)對細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長和增殖活性無明顯影響,具有較好的生物相容性。3) QDs-SA量子點(diǎn)能有效識(shí)別阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中APP和Aβ蛋白;QDs-SA量子點(diǎn)標(biāo)記APP和Aβ蛋白熒光成像在光穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的Cy3熒光染料標(biāo)記的免疫熒光成像。
【學(xué)位單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

③快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1一2分鐘;④每管加800川LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇;⑤將150川已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20mmol/LMgSO;和AMP抗性(100u留ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上;⑥將平板置于室溫直至液體被吸收;⑦倒置平皿，于37℃培養(yǎng)16小時(shí);⑧長出的克隆進(jìn)行后續(xù)PCR鑒定。柳挑選克隆行PCR鑒定，陽性克隆再抽提質(zhì)粒，并測序行進(jìn)一步鑒定。l)基本流程圖

圖1一3原始質(zhì)粗測序鑒定圖上圖編碼為06040082序列為待測序列，與NCBI公布人源APPcDNA序列比對發(fā)現(xiàn)第4位堿基由C突變?yōu)镚，同時(shí)在第1896和1897堿基位點(diǎn)存在并列突變(G一T，A~C).4.2點(diǎn)突變結(jié)果.4.2.1真核表達(dá)載體信息:一幾仍三一貶哎一三Pu.IH一。緒一8尸卜身V一工三巾m薈一仍m一比UO山>匡OU山薈一S中(--).崢藐藤套

50.bp250卜p圖1一 6PCR擴(kuò)增片段酶切電泳圖1:PCR片段酶切產(chǎn)物2:Marker 1.4.2.4PCR酶切產(chǎn)物連接入真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化行陽性克隆的PCR鑒定將酶切后的目的基因APP695與真核表達(dá)載體PcDNA3.1(一)相連接，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)培養(yǎng)后挑取克隆行PCR鑒定，篩選陽性克隆。如圖1一7所示，第12道在500bP左右可見目的條帶。5燦3燦2燦 1.5燦1燦一 50bP 500bp 250bp 100b

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡華;周德生;喻嶸;孫曉鵬;覃仁安;楊洋;王佳君;;復(fù)方丹參片對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型Aβ表達(dá)的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2012年12期

本文編號：2817781