發(fā)布時間：2020-08-28 13:14

　　 研究背景和目的 毒品問題是一個世界性的難題,毒品不僅造成嚴重的經(jīng)濟損失,更是加速了艾滋病和其他傳染病傳播,造成嚴重的社會倫理問題乃至政治問題。 有的學者認為阿片類成癮是一種慢性腦病。阿片類藥物極強的成癮性以及成癮后戒毒治療的困難和長期性使得在整個阿片類物質成癮治療過程中伴隨嚴重的急性戒斷癥狀。生理脫毒給患者帶來嚴重的生理心理痛苦,往往需要強制,使患者產生嚴重的對抗情緒,甚至喪失正常理智。因此長時間且有效地緩解急性戒斷癥狀,為患者提供一個舒適的生理脫毒期關系到后續(xù)治療能否繼續(xù),將影響整個戒毒治療成功與否。 到目前為止目前國際上常用的毒癮處置方法仍是用合成的阿片類鎮(zhèn)痛藥和低成癮性的美沙酮替代、遞減療法或將一些所謂的“軟性”毒品合法化以減少社會問題。更有激進者主張對成癮患者使用顱內與成癮相關的神經(jīng)核團永久毀損的方法來治療阿片類物質成癮。而其它治療方法也僅限于在短時間控制或暫時減輕急性戒斷癥狀。這些措施難使受到毒品長期侵襲的肌體回復到正常,而且導致原來劇烈的急性戒斷癥狀轉為慢性稽延性戒斷癥狀。對生理成癮機制的深入研究提示,內源性β-EP的不足特別是與成癮相關腦區(qū)神經(jīng)核團β-EP相對不足,是阿片類戒斷癥狀產生的重要神經(jīng)生物學機制之一,而且可能與情緒心理依賴形成有關。有研究報道,可以通過向中樞直接補充β-內啡肽而減輕戒斷癥狀。但直接補充外源性β-內啡肽的方法存在著有效作用時間短暫和反復多次中樞注射容易造成損傷感染和治療成本高昂等缺陷。 腺病毒載體具有高效地傳遞和表達基因的能力,但其主要缺點是引起機體的免疫反應,進入體內3-4周后基本消失。然而正是機體的免疫系統(tǒng)逐步清除腺病毒,使靶基因的表達梯度下降,用于急性脫毒治療時恰好可以提供給機體一個自我調節(jié)的時間窗,有利于機體內源性內啡肽物重新達到平衡狀態(tài)。表達β-EP的重組腺病毒Ad-NEP基因治療阿片類成癮可同時滿足替代療法、遞減療法兩個層面,因此我們提出使用重組腺病毒Ad-NEP來治療SD大鼠急性嗎啡戒斷綜合征。這個思路巧妙地利用了腺病毒在其它基因治療中的缺點,把它的這種會 被免疫系統(tǒng)最終清除的特征作為一種避免外來基因長期作用于機體的途徑。本課題基于以上思路,從病毒表達產物對離體器官的影響;腺病毒的給藥途徑、劑量、目的基因在大鼠腦脊液內的表達量與戒斷行為學評分指標之間的相關性以及對體重指標變化的影響做了初步探討。 方法 一.用皮下注射5日劑量逐步遞增法,建立大鼠急性嗎啡成癮模型。 二.感染Ad-NEP的HEK293細胞表達的β-EP對急性嗎啡成癮大鼠離體回腸戒斷性收縮的治療作用。 1.Ad-NEP和空腺病毒分別感染HEK293細胞,常規(guī)培養(yǎng)至第5天,收集上清液。放射免疫分析(RIA)法測定上清液中β-EP濃度,Krebs液稀釋上清液20倍,作為實驗離體回腸的水浴液。 2.實驗分四組。A組離體回腸水浴液由Krebs液構成,B組離體回腸水浴液由Krebs液+感染Ad-NEP的細胞上清(含有β-EP)構成,C組離體回腸水浴液由Krebs液+感染空病毒的細胞上清(不含β-EP)構成,D組離體回腸水浴液仍由Krebs液構成。A組為陰性對照組,D組為正常對照組。靜息張力Ig平衡30min后,水浴液中加入納洛酮。頸椎脫臼處死大鼠,取末端回腸制備成1.5cm長短的離體回腸標本。離體回腸基本外環(huán)境為37℃、Krebs液水浴液或Krebs液+細胞上清水浴液。所有水浴液均用95%O2+5%CO2混合氣體飽和。各實驗組測定離體回腸在納洛酮促發(fā)下的前后張力與收縮情況,推斷影響各實驗組收縮特征變化的因素。 三.重組腺病毒Ad-NEP對急性嗎啡成癮大鼠戒斷綜合癥的影響 1.篩選適用于大鼠側腦室注射的病毒劑量。制備5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011PFU五種不同滴度的Ad-NEP溶液30μl,分別注入健康正常大鼠側腦室,在注射后第4天采集大鼠腦脊液并其中β-EP濃度。另設一組注射生理鹽水的正常對照組。統(tǒng)計分析各個不同濃度組以及正常對照組的大鼠腦脊液β-EP濃度值,以病毒滴度對數(shù)值與腦脊液β-EP濃度值作相關性分析,推定適合大鼠側腦室注射的病毒滴度并討論表達物與所注射病毒滴度的相關性。 2.不同劑量Ad-NEP側腦室注射對急性嗎啡成癮大鼠戒斷癥狀的影響。 (1)建立急性嗎啡成癮大鼠模型,隨機分為四組:5×1010PFU組、5×109PFU組、Sham組、自然戒斷組。除自然戒斷組外,其余各組成癮大鼠均于成癮第5日晚向側腦室注射不同滴度Ad-NEP或生理鹽水。各組大鼠分別于術后第1、4、8、12天用納洛酮促發(fā)戒斷癥狀,由不知實驗分組的人員根據(jù)改良的Maldonado戒斷癥狀評分標準對大鼠進行戒斷行為學評分,并在評分后立即采集大鼠腦脊液標本以測定β-EP濃度。 (2)統(tǒng)計分析各組大鼠觀察期內每個標本采集時間點腦脊液中β-EP濃度值、戒斷行為學評分的差異以及整個觀察期兩個指標的變化程度并分析其相關性。 (3)觀察期內每天測量記錄每只大鼠體重,統(tǒng)計分析每組大鼠體重變化的趨勢和觀察期結束時體重缺失程度的差異。最后各組實驗大鼠死亡率行卡方檢驗。 結果 一.成功建立急性嗎啡成癮的大鼠活體模型。 二.1.獲得β-EP濃度為7575pg/mg的細胞培養(yǎng)上清液。 2.成功制備了急性嗎啡成癮大鼠的離體回腸標本。盡可能地縮短離體回腸熱缺血時間對收縮力的影響。納洛酮干預前,各成癮大鼠離體回腸收縮力與正常大鼠離體回腸收縮力相比有統(tǒng)計學差異(P0.05),提示急性嗎啡成癮大鼠的回腸收縮力高于正常大鼠。納洛酮干預前后的收縮力,陰性對照組、Krebs液+Ad-NEP感染上清組干預前后收縮力有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01);Krebs液+空病毒感染上清組、正常對照組干預前后收縮力無統(tǒng)計學差異(P0.05)。在觀察期內沒有觀察到納洛酮對正常大鼠離體回腸引起特異性的戒斷性收縮,而其它三組都觀察到了戒斷性收縮,Krebs液+Ad-NEP感染上清組戒斷性收縮的次數(shù)明顯少于另外兩組,數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)。提示用含β-EP的水浴液孵育后,可以減輕納洛酮促發(fā)急性嗎啡成癮大鼠離體回腸戒斷性收縮的程度和次數(shù)。 三.1.對于正常大鼠,滴度5×1011PFU劑量病毒注射有較高死亡率,不宜使用。滴度5×109PFU、5×1010PFU兩組實驗大鼠在注射后第4天腦脊液中β-EP濃度值均高于其他實驗組,數(shù)據(jù)差別有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)。 2.經(jīng)組內單因素方差分析,觀察期內兩個注射病毒組第4天β-EP濃度值最高,之后開始下降,而Sham組和自然戒斷組在第12天達到最高,但遠低于兩個病毒注射組,數(shù)據(jù)差異有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)。容量30μl、滴度5×109-10PFU劑量Ad-NEP側腦室注射可以顯著地降低急性嗎啡成癮大鼠在第4天的戒斷行為學評分(P0.01),而另兩組則在第12天才有顯著下降(P0.01)。腦脊液β-EP濃度值與大鼠戒斷行為學評分間存在負相關,第4天相關性最大,隨時間推移相關性減小。實驗結束時病毒注射組體重丟失百分比明顯少于Sham組和自然戒斷組,數(shù)據(jù)有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01);各組大鼠死亡率也有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)。提示Ad-NEP側腦室注射可以減輕大鼠戒毒期間的體重丟失,也可降低急性嗎啡成癮大鼠自然戒斷的死亡率。 結論 一.重組腺病毒表達的β-EP能有效對抗納洛酮所促發(fā)的急性嗎啡成癮大鼠離體回腸的痙攣性戒斷收縮,可在器官水平緩解阿片類戒斷綜合癥。 二.容積30μl,滴度5×109-10PFU是比較適合大鼠側腦室注射的病毒劑量。β-EP濃度值與所注射病毒的滴度對數(shù)值呈正相關。此劑量可以使實驗大鼠腦脊液獲得高濃度β-EP,同時也不會在實驗中造成實驗大鼠大量死亡。 三.側腦室注射Ad-NEP,可以改善納洛酮誘發(fā)的急性嗎啡成癮大鼠的戒斷癥狀。大鼠急性脫毒早期戒斷行為學評分下降與Ad-NEP所引起腦脊液β-EP濃度大幅度增高具有相關性,可能通過補充相關腦區(qū)β-EP來起作用,但這種相關性隨時間推移而下降,推斷在生理脫毒早期腦內相關腦區(qū)的β-EP缺失是引起急性戒斷綜合癥的主要矛盾,而后期β-EP角色的重要性下降。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R749.64
【部分圖文】：

表示與正�；啬c+Krebs 液組相比有統(tǒng)計學意義 P＜0.01；㥮表示與正�；啬c+Krebs 液+Ad-NEP 組相比有統(tǒng)計學意義 P＜0.01；▲表示干預前后組內相比有統(tǒng)計學意義 P＜0.01；圖 2：納洛酮干預前后各實驗組回腸收縮力的變化

A組促發(fā)前后（成癮回腸+Krebs液）

B組干預前后（成癮回腸+Krebs液+Ad-NEP感染上清）

【參考文獻】

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本文編號：2807623