【摘要】： 目的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,β淀粉樣蛋白(amyloid beta protein,Aβ)及其聚集形成的老年斑(senile plaques,SPs)是AD特異性病理學(xué)變化,Aβ聚集后有廣泛的毒性,被認(rèn)為是AD的關(guān)鍵致病物質(zhì)。大量研究證實(shí)Aβ對(duì)多種細(xì)胞有毒性作用,尤其是海馬和皮層神經(jīng)元。因此預(yù)防和拮抗Aβ的神經(jīng)毒作用是預(yù)防和治療AD的重要靶點(diǎn)。研究表明Aβ的直接毒性作用與神經(jīng)元細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān),表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的顯著升高。 二十二碳六烯酸(Ducosahexaenoic acid,DHA)是一種多不飽和脂肪酸,主要從深海魚(yú)和藻類(lèi)中提取出來(lái),是大腦皮層灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞膜n-3多不飽和脂肪酸的主要組分。大量流行病學(xué)調(diào)查及體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DHA對(duì)AD的認(rèn)知損害有保護(hù)作用,DHA能有效抑制Aβ的神經(jīng)毒作用,起到神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡等作用。我們以往的實(shí)驗(yàn)觀察到DHA的減少可以加重炎癥反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)元半胱氨酸蛋白酶(caspase)活化而加劇細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在觀察DHA對(duì)β淀粉樣蛋白25-35(Aβ_(25-35))致原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用,觀察DHA是否通過(guò)作用于Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元鈣超載,對(duì)Aβ神經(jīng)毒作用產(chǎn)生保護(hù),以進(jìn)一步研究DHA發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制或途徑。 方法 1.原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng):取新生1天的Wistar大鼠大腦皮層組織,制成的細(xì)胞懸液接種于經(jīng)過(guò)L-多聚賴(lài)氨酸包被的96孔板或培養(yǎng)皿中,置于37℃下5%CO_2培養(yǎng)箱孵育至第7DⅣ(dav in vitro,DⅣ)分5組進(jìn)行試驗(yàn)。 2.實(shí)驗(yàn)分組: (1)對(duì)照(Control)組:不加任何處理因素; (2)Abeta組:凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (3)低劑量DHA-Abeta組:DHA(20μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (4)中劑量DHA-Abeta組:DHA(50μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (5)高劑量DHA-Abeta組:DHA(100μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM)。 在培養(yǎng)至第7 DⅣ的DHA組皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液中加入DHA,維持DHA終濃度為20、50、100μmol/L,培養(yǎng)24小時(shí)后按檢測(cè)要求慢性孵育終濃度為25μmol/L Aβ_(25-35)24小時(shí)或者急性給予終濃度為25μmol/L Aβ_(25-35)。 3.檢測(cè)方法: (1)用CCK-8比色法觀察神經(jīng)元存活率; (2)用激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記有熒光染料Fluo-3/AM(5μM)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化(用細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度(F/F_b)的變化表示)。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 所有統(tǒng)計(jì)數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,不同處理組之間的檢驗(yàn)采用單因素方差分析,方差齊者組間比較用LSD(least significant difference)檢驗(yàn),方差不齊組間比較用Games-Howell檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05表示有顯著性差異。 結(jié)果 1.DHA拮抗Aβ誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)至第8DⅣ時(shí)(已按分組要求于第7DⅣ加入低、中、高劑量的DHA培養(yǎng)24小時(shí)),按分組要求加入凝聚態(tài)Aβ_(25-35)繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。與對(duì)照組相比,Abeta組神經(jīng)元表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒作用,即Abeta組中多數(shù)細(xì)胞胞體腫脹呈圓形,神經(jīng)元突起消失明顯,神經(jīng)元由貼壁生長(zhǎng)轉(zhuǎn)為懸浮生長(zhǎng),有大量死細(xì)胞;而提前孵育不同劑量DHA的三組細(xì)胞與Abeta組相比有顯著差別,上述毒性作用基本消失,低劑量及高劑量組中僅少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)元突起回縮、神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)變稀疏,中劑量組則細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,突起數(shù)目多、長(zhǎng)度長(zhǎng),網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)復(fù)雜。上述結(jié)果表明DHA對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒作用(神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)改變)有一定的抑制作用,其中中劑量DHA抑制作用最強(qiáng)。 2.DHA對(duì)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)元存活率下降的拮抗作用 與對(duì)照組相比,Abeta組神經(jīng)元存活率明顯下降(n=8,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)引起的神經(jīng)元存活率下降(n=8,P＜0.05),不同DHA劑量組比較差異有顯著性,中劑量DHA作用最強(qiáng)(n=8,P＜0.05)。 3.DHA對(duì)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)元鈣超載的拮抗作用 與對(duì)照組相比,Abeta組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度顯著持續(xù)升高(n=15,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高(n=15,P＜0.05),不同DHA劑量組比較差異有顯著性,中劑量DHA作用最強(qiáng)(n=15,P＜0.05)。 結(jié)論 1.Aβ_(25-35)可引起體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元存活率下降及胞內(nèi)游離鈣離子濃度的顯著持續(xù)升高; 2.Aβ誘導(dǎo)的鈣超載可能是Aβ神經(jīng)毒作用的重要方面; 3.DHA可部分拮抗Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的鈣超載,可能是DHA拮抗Aβ神經(jīng)毒作用發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16
【圖文】：

注:與*相比:林p<0.05，#p<0.05，##p<0.05，###p<0.05;與林相比:#p<0.05，##p<0.05，<0.05:與#相比，##p<0.05，###p<0.05.圖2一:各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子相對(duì)熒光強(qiáng)度在給予Ap后升高(對(duì)照組除外)井隨時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)，。8ssseCO.trolll一一A加taaaLLLoWDRA·Abetaaa一一M湯ddleDHA.Abetaaa——H啥bDHA一betaaa伽擴(kuò)lr1JJ1.............ZSM幼2.o:6注.o月.月.月.曰.蘿炭9.月名，留舒。爪‘國(guó)弓.國(guó)名感蓄

【引證文獻(xiàn)】

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1 張余權(quán);周盛敏;姜元榮;沈麗珍;夏樹(shù)華;梁俊梅;;n-3多不飽和脂肪酸對(duì)中老年人群精神及視力影響的研究進(jìn)展[J];食品工業(yè)科技;2012年07期

本文編號(hào)：2792940