【摘要】： 目的阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,β淀粉樣蛋白(amyloid beta protein,Aβ)及其聚集形成的老年斑(senile plaques,SPs)是AD特異性病理學變化,Aβ聚集后有廣泛的毒性,被認為是AD的關鍵致病物質。大量研究證實Aβ對多種細胞有毒性作用,尤其是海馬和皮層神經元。因此預防和拮抗Aβ的神經毒作用是預防和治療AD的重要靶點。研究表明Aβ的直接毒性作用與神經元細胞的鈣穩(wěn)態(tài)失衡有關,表現(xiàn)為神經元細胞內游離鈣離子濃度的顯著升高。 二十二碳六烯酸(Ducosahexaenoic acid,DHA)是一種多不飽和脂肪酸,主要從深海魚和藻類中提取出來,是大腦皮層灰質神經元細胞膜n-3多不飽和脂肪酸的主要組分。大量流行病學調查及體內試驗發(fā)現(xiàn)DHA對AD的認知損害有保護作用,DHA能有效抑制Aβ的神經毒作用,起到神經保護、抗凋亡等作用。我們以往的實驗觀察到DHA的減少可以加重炎癥反應和促進神經元半胱氨酸蛋白酶(caspase)活化而加劇細胞凋亡。本實驗設計旨在觀察DHA對β淀粉樣蛋白25-35(Aβ_(25-35))致原代培養(yǎng)皮層神經元損傷的保護作用,觀察DHA是否通過作用于Aβ誘導的神經元鈣超載,對Aβ神經毒作用產生保護,以進一步研究DHA發(fā)揮神經保護作用的機制或途徑。 方法 1.原代皮層神經元培養(yǎng):取新生1天的Wistar大鼠大腦皮層組織,制成的細胞懸液接種于經過L-多聚賴氨酸包被的96孔板或培養(yǎng)皿中,置于37℃下5%CO_2培養(yǎng)箱孵育至第7DⅣ(dav in vitro,DⅣ)分5組進行試驗。 2.實驗分組: (1)對照(Control)組:不加任何處理因素; (2)Abeta組:凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (3)低劑量DHA-Abeta組:DHA(20μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (4)中劑量DHA-Abeta組:DHA(50μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM); (5)高劑量DHA-Abeta組:DHA(100μM)+凝聚態(tài)Aβ_(25-35)(25μM)。 在培養(yǎng)至第7 DⅣ的DHA組皮層神經元培養(yǎng)液中加入DHA,維持DHA終濃度為20、50、100μmol/L,培養(yǎng)24小時后按檢測要求慢性孵育終濃度為25μmol/L Aβ_(25-35)24小時或者急性給予終濃度為25μmol/L Aβ_(25-35)。 3.檢測方法: (1)用CCK-8比色法觀察神經元存活率; (2)用激光共聚焦顯微鏡觀察標記有熒光染料Fluo-3/AM(5μM)的神經元細胞內游離鈣離子濃度的變化(用細胞內游離鈣離子相對熒光強度(F/F_b)的變化表示)。 4.統(tǒng)計學處理: 所有統(tǒng)計數(shù)值以均數(shù)±標準差((?)±s)表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,不同處理組之間的檢驗采用單因素方差分析,方差齊者組間比較用LSD(least significant difference)檢驗,方差不齊組間比較用Games-Howell檢驗,檢驗水準α=0.05,P＜0.05表示有顯著性差異。 結果 1.DHA拮抗Aβ誘導的皮層神經元形態(tài)學改變 皮層神經元原代培養(yǎng)至第8DⅣ時(已按分組要求于第7DⅣ加入低、中、高劑量的DHA培養(yǎng)24小時),按分組要求加入凝聚態(tài)Aβ_(25-35)繼續(xù)培養(yǎng)24小時。與對照組相比,Abeta組神經元表現(xiàn)出明顯的神經毒作用,即Abeta組中多數(shù)細胞胞體腫脹呈圓形,神經元突起消失明顯,神經元由貼壁生長轉為懸浮生長,有大量死細胞;而提前孵育不同劑量DHA的三組細胞與Abeta組相比有顯著差別,上述毒性作用基本消失,低劑量及高劑量組中僅少數(shù)細胞出現(xiàn)了不同程度的神經元突起回縮、神經纖維網絡變稀疏,中劑量組則細胞生長旺盛,突起數(shù)目多、長度長,網狀結構復雜。上述結果表明DHA對Aβ誘導的神經毒作用(神經元形態(tài)結構改變)有一定的抑制作用,其中中劑量DHA抑制作用最強。 2.DHA對Aβ_(25-35)誘導的神經元存活率下降的拮抗作用 與對照組相比,Abeta組神經元存活率明顯下降(n=8,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)引起的神經元存活率下降(n=8,P＜0.05),不同DHA劑量組比較差異有顯著性,中劑量DHA作用最強(n=8,P＜0.05)。 3.DHA對Aβ_(25-35)誘導的神經元鈣超載的拮抗作用 與對照組相比,Abeta組神經元細胞內游離鈣離子濃度顯著持續(xù)升高(n=15,P＜0.05);孵育DHA可降低Aβ_(25-35)誘導的神經元細胞內游離鈣離子濃度升高(n=15,P＜0.05),不同DHA劑量組比較差異有顯著性,中劑量DHA作用最強(n=15,P＜0.05)。 結論 1.Aβ_(25-35)可引起體外原代培養(yǎng)皮層神經元存活率下降及胞內游離鈣離子濃度的顯著持續(xù)升高; 2.Aβ誘導的鈣超載可能是Aβ神經毒作用的重要方面; 3.DHA可部分拮抗Aβ_(25-35)誘導的鈣超載,可能是DHA拮抗Aβ神經毒作用發(fā)揮保護作用的重要機制。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.16
【圖文】：

注:與*相比:林p<0.05，#p<0.05，##p<0.05，###p<0.05;與林相比:#p<0.05，##p<0.05，<0.05:與#相比，##p<0.05，###p<0.05.圖2一:各組細胞內游離鈣離子相對熒光強度在給予Ap后升高(對照組除外)井隨時間延長達，。8ssseCO.trolll一一A加taaaLLLoWDRA·Abetaaa一一M湯ddleDHA.Abetaaa——H啥bDHA一betaaa伽擴lr1JJ1.............ZSM幼2.o:6注.o月.月.月.曰.蘿炭9.月名，留舒。爪‘國弓.國名感蓄

【引證文獻】

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1 張余權;周盛敏;姜元榮;沈麗珍;夏樹華;梁俊梅;;n-3多不飽和脂肪酸對中老年人群精神及視力影響的研究進展[J];食品工業(yè)科技;2012年07期

本文編號：2792940