【摘要】： 研究背景 氯胺酮(ketamine)是苯環(huán)己哌啶(N-1-phenycyclohexy-piperidine,PCP)的衍生物,屬N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體拮抗劑,臨床用于手術麻醉。氯胺酮俗稱“K粉”,上一世紀70年代初首先在美國發(fā)生流行性濫用,20世紀90年代以來,隨著全球范圍日益嚴重的“舞會藥”(party drug)濫用,氯胺酮濫用很快蔓延至亞洲地區(qū)并波及至中國大陸,常被濫用于娛樂場所,是目前較為流行的新型毒品之一。我國對氯胺酮制劑一直采取嚴密的管制措施,氯胺酮1996年被列入國家基本藥物,由于近年來日益嚴重的濫用問題,氯胺酮于2002年被列入二類精神藥品管制,2005年1月又被列入一類精神藥品管制。 藥物依賴涉及CNS復雜的神經(jīng)機制及中樞內(nèi)眾多的神經(jīng)核團。到目前為止,藥物依賴的形成機制一直未能明確。氯胺酮作為NMDA受體拮抗劑,可非競爭性抑制NMDA受體的活性。由于谷氨酸與NMDA受體在藥物依賴的形成和發(fā)展過程中起著重要作用,NMDA受體拮抗劑被認為可抑制藥物成癮的依賴癥狀。因此,氯胺酮可通過拮抗NMDA受體而抑制成癮性藥物的依賴性形成和戒斷反應。動物實驗表明氯胺酮可抑制嗎啡依賴大、小鼠的催促戒斷癥狀,臨床上也有使用氯胺酮治療阿片成癮者戒斷癥狀的報道。但流行病學調(diào)查及吸毒者心理狀況分析的結果表明,氯胺酮與其他精神興奮性物質,如甲基苯丙胺合并使用后,可明顯增強了病人對成癮性物質的渴求和精神依賴。 在我們已完成的國家自然科學基金項目中,氯胺酮原設計作為抑制NMDA受體的陽性對照藥,與中藥有效成分的抗NMDA受體作用進行對照。我們的研究發(fā)現(xiàn),氯胺酮和甲基苯丙胺單獨使用、或兩藥合用均可使小鼠產(chǎn)生條件性位置偏愛(CPP),而氯胺酮與甲基苯丙胺聯(lián)合引起的CPP效應的維持時間比兩藥單獨使用導致的CPP明顯延長。氯胺酮還能明顯增強苯丙胺的中樞興奮性。我們首先在動物模型上證明了氯胺酮具有很強的精神依賴性潛力。國內(nèi)外的相關報道與我們的研究結果基本一致。 研究目的 在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后致密體(PSD)中,NMDA受體和AMPA受體存在大量共定位現(xiàn)象,即NMDA受體和AMPA受體共存于同一突觸。兩種受體亞單位在突觸中組合成特定的共定位簇,這種共定位的關系隨著神經(jīng)細胞的發(fā)育的不同階段而呈現(xiàn)異質性,相對于NMDA受體的穩(wěn)定,突觸后膜上的AMPA受體的狀態(tài)和數(shù)目是高度可變的,這種變化對于調(diào)節(jié)突觸傳遞效能起著十分重要的作用。近年來相關的研究表明,在依賴性藥物作用下中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)及相關腦區(qū)神經(jīng)元上AMPA受體的功能或數(shù)量早期即發(fā)生了一系列的變化,從而進一步介導了許多后續(xù)效應的發(fā)生與維持,AMPA受體的改變可能是觸發(fā)藥物依賴的“扳機”�？傊�,在藥物成癮方面,NMDA受體和AMPA受體的之間的關系是緊密聯(lián)系又互為影響的,單獨研究一方面而忽略另一方面都是不可取的。 本課題研究在離體環(huán)境下,氯胺酮造成的成癮性神經(jīng)元樣PC12細胞中,NMDA受體和AMPA受體的表達情況,并使用中藥鉤藤中的主要有效成分鉤藤堿進行干預,探索氯胺酮的成癮機制和中藥鉤藤臨床抗藥物成癮的機理。 實驗方法和結果 1.神經(jīng)元樣細胞模型的建立:PC12 CELLS鼠嗜咯細胞瘤細胞系(PC12 ratpheochromocytoma cells,PC12 cells),是一種從鼠嗜鉻細胞瘤分離的克隆細胞,因其在神經(jīng)生長因子(NGF)存在下,細胞在形態(tài)、結構和功能皆類似于交感神經(jīng)細胞,因而成為近年來神經(jīng)科學工作者研究神經(jīng)細胞遞質合成、儲存和釋放、離子通道及受體的細胞模型。PC12細胞含有T、L、N型鈣通道及NMDA受體,PC12細胞的NMDA受體與海馬神經(jīng)元上的一致,并且PC12細胞在分化前后都表達AMPA受體二型亞單位GluR2的mRNA(GIuR-B flip mRNA)。 相對于原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞,PC12 cells易于獲取,在培養(yǎng)中貼壁率高,繁殖速度快,傳代穩(wěn)定。本課題選用PC12 cells,通過NGF的刺激誘導,使PC12細胞成功的分化為神經(jīng)元樣細胞,不僅符合神經(jīng)元細胞的各種形態(tài)特征,而且通過免疫組化法成功的檢測出了NMDA和AMPA受體的表達,建立了合適的細胞模型。 2.氯胺酮和鉤藤堿的細胞毒實驗:阿片類,苯丙胺類導致離體的神經(jīng)細胞成癮的作用時間約為48小時左右。時間太短無法建立起成癮模型,太長又因本身的細胞毒作用導致神經(jīng)細胞的衰亡。我們實驗設計氯胺酮導致細胞成癮的時間為48小時,通過施加不同劑量的氯胺酮在神經(jīng)性PC12細胞上,考察藥物對細胞的損傷程度,同時對比不同劑量組的鉤藤堿,用MTT法測定氯胺酮和鉤藤堿對細胞活力的影響。 從實驗結果我們可以看出:持續(xù)用藥48小時后,PC12 Cells的細胞活力隨著氯胺酮濃度的不斷升高而呈現(xiàn)下降的趨勢,當氯胺酮濃度大于1mmol/L的時候,細胞活力開始降低。1.5mmol/L和2.0mmol/L濃度組和對照組相比有顯著差異(P＜0.01),說明氯胺酮的最大安全劑量為1mmol/L.和氯胺酮處理組相比,施加不同劑量鉤藤堿處理后各組中的細胞活力均和正常對照無顯著差異,鉤藤堿在0.25～1.00 mmol/L范圍內(nèi)對PC12 Cells都是安全的。 3.免疫熒光法測定PC12細胞上NMDA受體和AMPA受體的表達:免疫熒光細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。本實驗通過免疫熒光技術檢測氯胺酮對神經(jīng)元樣PC12細胞上NMDA受體NR1亞單位和AMPA受體亞單位GluR2/3蛋白表達的影響,分析NMDA受體和AMPA受體在氯胺酮成癮中起到的作用,并用中藥成分鉤藤堿進行干預,探討鉤藤堿抗成癮機制。按藥物對細胞的不同處理方法分為八個組:空白對照(Control)一組,氯胺酮一個組,鉤藤堿三組,鉤藤堿和氯胺酮合并處理三組。接種于96孔板中PC12細胞用NGF誘導分化成熟后,吸凈陪養(yǎng)基,PBS液洗孔后加入基礎培養(yǎng)基(CONTROL)一組,Ketamine(終濃度為1mmol/L)一組,Rhy三組(終濃度分別為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L),合并用藥的三個組提前加入鉤藤堿,孵箱中孵育15分鐘后再加入氯胺酮(Rhy各組終濃度分別為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L;Ketamine終濃度為1mmol/L),全板共八組,每組加藥10孔。加藥完畢后將96孔板置于孵箱中培育(恒溫37℃,5%CO2)48小時。48小時后進行免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下觀察和采集圖象,用Image-Pro Plus 6.0進行分析,統(tǒng)計每個視野陽性區(qū)的平均光密度(MeanDensity)值。值越高則說明NR1和GluR2/3蛋白的表達越強烈。 從實驗結果可以看出:①在AMPA受體方面,對細胞施加了1mmol/L的KETA后GluR2/3蛋白的表達和正常對照組存在顯著差異(P＜0.01),表達明顯增強。RHY的0.25,0.50,1.00 mmol/L的低中高三個劑量組中GluR2/3蛋白表達均和正常組無顯著差異。合并用藥的三個組中RHY 1mmol/L+KETA 1mmol/L組中GluR2/3蛋白表達和正常組有顯著差異(P＜0.01),表達增強;而其他兩個組均和正常組無顯著差異。②在NMDA受體方面,八個處理組中除了RHY 1mmol/L組和正常組有顯著差異(P＜0.05)外其他七組均無差異。③對比AMPA受體亞單位GluR2/3和NMDA受體亞單位NR1,可以看出除了1mmol/L的KETA組,其他各處理組中NR1蛋白的表達水平總體在GluR2/3之上,而1mmol/L的氯胺酮顯著上調(diào)了GluR2/3蛋白的表達,甚至超過了NR1蛋白的表達水平。 結論 1.驗證了神經(jīng)元樣PC12細胞做為研究谷氨酸受體的平臺,是一種非常有效的研究工具。 2.考察了氯胺酮對細胞成癮的合理劑量范圍,并在細胞毒性方面對鉤滕堿的安全性做出了評估,表明鉤藤堿是一種非常安全的成分。 3.揭示了AMPA受體在氯胺同酮成癮機制中起到了非常關鍵的作用,而鉤藤堿的抗成癮作用也是通過影響AMPA受體來體現(xiàn)的。 討論 通過研究我們提出一種設想,氯胺酮的“選擇性抑制”和鉤藤堿的“占用效應”理論來解釋:在一定條件下,氯胺酮只抑制突觸后膜的NMDA受體(我們推測這種受體一定是和AMPA受體的共定位受體簇,比如NR1-GluR2/3的共定位簇),可以表現(xiàn)出對阿片類,苯并胺類的抗成癮作用。但當藥物刺激超過一定程度(例如時間和劑量等),細胞內(nèi)休眠的AMPAR被再次激活,產(chǎn)生一種動態(tài)分布效應,AMPA受體不斷被錨定到突觸后膜上,又通過胞引作用進入到細胞內(nèi),使細胞間產(chǎn)生一種鏈式反應,這種反應導致所謂的“靜寂突觸”的激活(突觸后膜上只有NMDA受體,而沒有功能性AMPA受體的突觸),即NMDA受體通過所“征募”到的AMPA受體而被“喚醒”,極有可能形成新的NMDAR-AMPAR的共定位受體簇。這樣,氯胺酮的成癮性表現(xiàn)出來。 為什么氯胺酮和鉤藤堿同為NMDA受體的非競爭性拮抗劑,但鉤藤堿卻無成癮性和致幻作用呢?這是因為鉤藤堿在占據(jù)NMDA受體位點時的非選擇性,鉤藤堿攻擊這些結合位點的時候,不像氯胺酮那樣只占據(jù)和刺激與AMPA受體形成共定位簇的NMDA位點,而是只要表現(xiàn)出NMDA受體特征的任何位點全部占據(jù),包括“靜寂突觸”上的結合位點(這可能是鉤藤堿下調(diào)了NR1蛋白的表達的原因之一),所以當這些位點全被占滿以后,一方面導致細胞內(nèi)休眠的AMPA受體無法通過刺激這些共定位簇的位點而復蘇(這解釋了為什么單獨使用鉤藤堿并不上調(diào)GluR2/3蛋白的表達),另一方面即便有自由的AMPA受體卻也找不到多余的可供結合的NMDA受體位點,氯胺酮也就無法通過激活AMPA受體來活化NMDA受體的除極化反應,一系列的神經(jīng)傳導信號被阻斷,這就是鉤藤堿對氯胺酮的干預機制和其抗成癮機理 總之,氯胺酮的成癮性和NMDA和AMPA受體間的交互作用有著極大的關系,成癮后導致的AMPA/NMDA比值的偏移并不能簡單的定義為絕對的升高或降低,但仍然可以看出AMPA受體在氯胺酮的成癮過程中發(fā)揮了關鍵性的作用,中藥成分鉤藤堿的抗成癮作用也是通過NMDA-AMPA受體通路的復雜調(diào)控來實現(xiàn)的。至于氯胺酮具體是通過一種什么樣的途徑來影響AMPA受體,氯胺酮和鉤藤堿在分子構型上對NMDA受體和AMPA結合位點的作用有何差異,則有待進一步深入研究。 注:本論文中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0進行分析。多組間比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),各組均數(shù)的多重比較采用最小顯著差值法(leastsignificant different,LSD);不滿足方差齊性要求是,采用Dunnett's T3法。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.6;R285
【圖文】：

一免疫組化法檢測NRl和G1uR2/3陽性細胞A:空白對照組((400x).B:NRl陽性染色組(400x).C:G1uR2/3陽性染色組(400x).Figure2-2NRlandGluR2/3positivecellsdetectedbyimmunohistochemicalmetho

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