【摘要】：背景精神分裂癥(Schizophrenia,SZ)是一種神經(jīng)系統(tǒng)受損的衰弱性精神疾病,具有神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙、前額皮質(zhì)神經(jīng)元異常分布等與神經(jīng)元密切相關(guān)的病理特征。雖然大量的尸檢數(shù)據(jù)、動物模型和成像模式為該病病理及生理研究提供了理論依據(jù),但臨床試驗中仍然缺乏適當(dāng)?shù)募膊∧Ｐ�。iPS技術(shù)的出現(xiàn)為SZ的病理研究提供新的細(xì)胞疾病模型,為深入研究其發(fā)病機制和臨床治療提供基礎(chǔ)。目的1.本文通過單因素比較獲得高效率慢病毒包裝所需細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度,為iPSCs(Induced Pluripotent Stem Cells,i PSCs)重編程提供技術(shù)保障。2.將SZ患者的PBMCs(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs)通過慢病毒轉(zhuǎn)染OKSM轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行重編程,建立精神分裂癥的iPSCs模型,并對該模型的核型以及炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行分析檢測。方法1.利用293T細(xì)胞,在接種相同密度的前提下,分別培養(yǎng)不同時間(19h、24h和29h)后進(jìn)行病毒包裝;在培養(yǎng)相同時間(24h)前提下,接種不同密度的293T細(xì)胞后包裝病毒;通過對兩個變量的比較獲得高效率慢病毒包裝所需細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度。2.利用質(zhì)粒pEP4EO2SEM2K,通過PCR技術(shù)擴增C-MYC-IRES2-KLF4和OCT4-IRES2-SOX2這兩個片段,然后分別將PCR產(chǎn)物克隆到慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry上,最終成功構(gòu)建兩種慢病毒質(zhì)粒。3.慢病毒包裝及效率檢測。通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將上述兩種重組質(zhì)粒作為目的質(zhì)粒分別結(jié)合包裝質(zhì)粒pMD2.G、pSPAX2進(jìn)行慢病毒包裝,通過低溫超速離心法濃縮收集慢病毒顆粒。將慢病毒濃縮液分別按濃度梯度侵染293T細(xì)胞,通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞技術(shù)檢測慢病毒侵染效率。4.將SZ患者PBMCs誘導(dǎo)成iPSCs,并鑒定。選取上述兩種合適滴度的病毒顆粒,共同侵染誘導(dǎo)PBMCs。重編程成功后,即可通過ALP染色、PCR、免疫熒光等技術(shù)對細(xì)胞克隆的多能性和體外分化能力進(jìn)行檢測。5.利用吉姆薩染色進(jìn)行SZ患者來源iPSCs模型的核型分析。6.利用qRT-PCR技術(shù)比較SZ患者和正常人來源iPSCs中炎癥因子表達(dá)水平的高低。結(jié)果1.實驗發(fā)現(xiàn)利用75cm~2培養(yǎng)瓶包裝慢病毒時,接種5-7.5×10~6個細(xì)胞于24h后進(jìn)行慢病毒包裝能夠獲得較高效率的慢病毒。2.本實驗成功構(gòu)建了誘導(dǎo)iPSCs所需要的重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-OCT4-IRES2-SOX2(以下簡稱OCT4/SOX2)和pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4(以下簡稱C-MYC/KLF4);這兩種質(zhì)粒分別作為目的質(zhì)粒結(jié)合包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后能夠成功包裝出2種高效的慢病毒。3.通過ALP染色、PCR、免疫熒光等各種技術(shù)對細(xì)胞克隆的多能性和體外分化能力檢測成功將SZ患者的PBMCs重編程為iPSCs。4.分析檢測發(fā)現(xiàn)SZ來源的iPSCs模型核型無異常,但其炎癥因子的表達(dá)水平明顯高于正常來源的iPSCs。結(jié)論1.通過單因素比較獲得高效率慢病毒包裝所需細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度。2.成功建立了精神分裂癥患者外周血單個核細(xì)胞來源iPSCs模型,為后續(xù)建立精神分裂癥的神經(jīng)細(xì)胞模型,研究SZ發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.3
【圖文】：

2-24h）和29h（T3-29h）后進(jìn)行病毒包裝。如圖1A和1B所示，293T細(xì)胞的生細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間逐漸增加，但圖1C的細(xì)胞周期檢測說明細(xì)胞處于 G1的數(shù)目并隨著培養(yǎng)時間的延長無明顯變化。之后對3組細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，如圖1D所示，T2-24h和T3-29h兩組病毒包裝48h后GFP表達(dá)強度均明顯19h組。

expression level of GFP at 48h after viral packaging. Scale bar, 50μm.2.1.2 不同培養(yǎng)時間慢病毒侵染效率組間的比較為了進(jìn)一步檢測3組慢病毒侵染效率，將濃縮的病毒液按照0μL，1μL，2μL，4μL的梯度侵染293T細(xì)胞，48h后鏡下觀察細(xì)胞GFP熒光表達(dá)情況并拍照，結(jié)果如圖2A所示。流式上機檢測，細(xì)胞熒光表達(dá)率如圖2B所示。鏡下觀察各GFP表達(dá)量與流式檢測結(jié)果基本一致，二者結(jié)果均表明T2-24h和T3-29h組所包裝病毒的侵染效率基本相同，但明顯高于T1-19h組所包裝病毒的侵染效率。

29圖3.包裝細(xì)胞不同接種密度組轉(zhuǎn)染效率間的比較注：A為包裝前各接種密度的細(xì)胞生長密度；B為包裝前各接種密度的細(xì)胞數(shù)量；C為包種密度的細(xì)胞周期檢測；D為病毒包裝48h后GFP熒光表達(dá)量。標(biāo)尺，50μm。Fig. 3. The transfection efficiency of packaging cells in different seeding densityote: A, the density of cell growt h at eachseeding density before packaging; B, the number oach seeding density before packaging; C, the detection of cell cycle in different seeding densackaging; D, the expression of GFP after 48h viral packaging. Scale bar, 50μm..1.4 不同接種密度慢病毒侵染效率組間的比較為了進(jìn)一步檢測3組慢病毒侵染效率，將病毒濃縮液按照1 μL，2 μL，4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Ping Lu;Xiaolong Chen;Yun Feng;Qiao Zeng;Cizhong Jiang;Xianmin Zhu;Guoping Fan;Zhigang Xue;;Integrated transcriptome analysis of human iPS cells derived from a fragile X syndrome patient during neuronal differentiation[J];Science China(Life Sciences);2016年11期

2 Fabiele B Russo;Fernanda R Cugola;Isabella R Fernandes;Graciela C Pignatari;Patricia C B Beltr?o-Braga;;Induced pluripotent stem cells for modeling neurological disorders[J];World Journal of Transplantation;2015年04期

本文編號：2763979