【摘要】：背景精神分裂癥(Schizophrenia,SZ)是一種神經(jīng)系統(tǒng)受損的衰弱性精神疾病,具有神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙、前額皮質(zhì)神經(jīng)元異常分布等與神經(jīng)元密切相關的病理特征。雖然大量的尸檢數(shù)據(jù)、動物模型和成像模式為該病病理及生理研究提供了理論依據(jù),但臨床試驗中仍然缺乏適當?shù)募膊∧Ｐ�。iPS技術的出現(xiàn)為SZ的病理研究提供新的細胞疾病模型,為深入研究其發(fā)病機制和臨床治療提供基礎。目的1.本文通過單因素比較獲得高效率慢病毒包裝所需細胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度,為iPSCs(Induced Pluripotent Stem Cells,i PSCs)重編程提供技術保障。2.將SZ患者的PBMCs(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs)通過慢病毒轉染OKSM轉錄因子進行重編程,建立精神分裂癥的iPSCs模型,并對該模型的核型以及炎癥因子的表達進行分析檢測。方法1.利用293T細胞,在接種相同密度的前提下,分別培養(yǎng)不同時間(19h、24h和29h)后進行病毒包裝;在培養(yǎng)相同時間(24h)前提下,接種不同密度的293T細胞后包裝病毒;通過對兩個變量的比較獲得高效率慢病毒包裝所需細胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度。2.利用質(zhì)粒pEP4EO2SEM2K,通過PCR技術擴增C-MYC-IRES2-KLF4和OCT4-IRES2-SOX2這兩個片段,然后分別將PCR產(chǎn)物克隆到慢病毒載體pLVX-IRES-mCherry上,最終成功構建兩種慢病毒質(zhì)粒。3.慢病毒包裝及效率檢測。通過磷酸鈣轉染法將上述兩種重組質(zhì)粒作為目的質(zhì)粒分別結合包裝質(zhì)粒pMD2.G、pSPAX2進行慢病毒包裝,通過低溫超速離心法濃縮收集慢病毒顆粒。將慢病毒濃縮液分別按濃度梯度侵染293T細胞,通過熒光顯微鏡觀察和流式細胞技術檢測慢病毒侵染效率。4.將SZ患者PBMCs誘導成iPSCs,并鑒定。選取上述兩種合適滴度的病毒顆粒,共同侵染誘導PBMCs。重編程成功后,即可通過ALP染色、PCR、免疫熒光等技術對細胞克隆的多能性和體外分化能力進行檢測。5.利用吉姆薩染色進行SZ患者來源iPSCs模型的核型分析。6.利用qRT-PCR技術比較SZ患者和正常人來源iPSCs中炎癥因子表達水平的高低。結果1.實驗發(fā)現(xiàn)利用75cm~2培養(yǎng)瓶包裝慢病毒時,接種5-7.5×10~6個細胞于24h后進行慢病毒包裝能夠獲得較高效率的慢病毒。2.本實驗成功構建了誘導iPSCs所需要的重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-OCT4-IRES2-SOX2(以下簡稱OCT4/SOX2)和pLVX-C-MYC-IRES2-KLF4(以下簡稱C-MYC/KLF4);這兩種質(zhì)粒分別作為目的質(zhì)粒結合包裝質(zhì)粒轉染293T細胞后能夠成功包裝出2種高效的慢病毒。3.通過ALP染色、PCR、免疫熒光等各種技術對細胞克隆的多能性和體外分化能力檢測成功將SZ患者的PBMCs重編程為iPSCs。4.分析檢測發(fā)現(xiàn)SZ來源的iPSCs模型核型無異常,但其炎癥因子的表達水平明顯高于正常來源的iPSCs。結論1.通過單因素比較獲得高效率慢病毒包裝所需細胞的最佳培養(yǎng)時間和接種密度。2.成功建立了精神分裂癥患者外周血單個核細胞來源iPSCs模型,為后續(xù)建立精神分裂癥的神經(jīng)細胞模型,研究SZ發(fā)病機制奠定了基礎。
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.3
【圖文】：

2-24h）和29h（T3-29h）后進行病毒包裝。如圖1A和1B所示，293T細胞的生細胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時間逐漸增加，但圖1C的細胞周期檢測說明細胞處于 G1的數(shù)目并隨著培養(yǎng)時間的延長無明顯變化。之后對3組細胞進行病毒包裝，如圖1D所示，T2-24h和T3-29h兩組病毒包裝48h后GFP表達強度均明顯19h組。

expression level of GFP at 48h after viral packaging. Scale bar, 50μm.2.1.2 不同培養(yǎng)時間慢病毒侵染效率組間的比較為了進一步檢測3組慢病毒侵染效率，將濃縮的病毒液按照0μL，1μL，2μL，4μL的梯度侵染293T細胞，48h后鏡下觀察細胞GFP熒光表達情況并拍照，結果如圖2A所示。流式上機檢測，細胞熒光表達率如圖2B所示。鏡下觀察各GFP表達量與流式檢測結果基本一致，二者結果均表明T2-24h和T3-29h組所包裝病毒的侵染效率基本相同，但明顯高于T1-19h組所包裝病毒的侵染效率。

29圖3.包裝細胞不同接種密度組轉染效率間的比較注：A為包裝前各接種密度的細胞生長密度；B為包裝前各接種密度的細胞數(shù)量；C為包種密度的細胞周期檢測；D為病毒包裝48h后GFP熒光表達量。標尺，50μm。Fig. 3. The transfection efficiency of packaging cells in different seeding densityote: A, the density of cell growt h at eachseeding density before packaging; B, the number oach seeding density before packaging; C, the detection of cell cycle in different seeding densackaging; D, the expression of GFP after 48h viral packaging. Scale bar, 50μm..1.4 不同接種密度慢病毒侵染效率組間的比較為了進一步檢測3組慢病毒侵染效率，將病毒濃縮液按照1 μL，2 μL，4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

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本文編號：2763979