【摘要】：第一部分氟西汀對AD轉基因小鼠行為學及內(nèi)側前額葉皮質體積的作用目的:已有研究表明氟西汀能夠改善AD的認知功能,但其機制仍不清楚。內(nèi)側前額葉皮質(MPFC)為AD受累的主要腦區(qū)之一,多項研究表明在阿爾茨海默病(AD)疾病的早期,一定比例的AD患者存在明顯的執(zhí)行功能障礙,而且AD患者會伴有顯著的與執(zhí)行功能障礙和相關的前額葉皮質萎縮。因此,本研究主要探討氟西汀對AD轉基因小鼠行為學、MPFC體積及其內(nèi)Aβ蛋白沉積和Tau蛋白磷酸化的作用。1[基金項目]國家自然科學基金(81671259,81871073,81801269),重慶市首屆百名學術學科領軍人才培養(yǎng)資助經(jīng)費(2012),the 2016 Supporting Innovation Projects of Graduate Students of Chongqing,and the 2016 Supporting Excellent Ph.D Projects of Chongqing Medical University.方法:選取40只8月齡的雄性APP/PS1雙轉基因AD小鼠,以及40只8月齡同窩生野生型小鼠。8月齡的AD轉基因小鼠被隨機分為AD生理鹽水組(AD+NS)和AD氟西汀組(AD+FLX),8月齡的同窩生野生型(WT)小鼠則分為野生型生理鹽水組(WT+NS)和野生型氟西汀組(WT+FLX)。給予AD+FLX組及WT+FLX組小鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg/d),持續(xù)2個月。同時,給予相應月齡AD+NS組及WT+NS組小鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。其中每組在氟西汀干預的第5周給予連續(xù)7天的BrdU腹腔注射(50mg/kg/d)。每周均檢測4組小鼠的體質量。為期2個月的干預后,對各組小鼠進行曠場測試,以檢測小鼠的運動能力和焦慮樣行為;運用Morris水迷宮測試小鼠的空間學習和記憶能力;運用Y迷宮檢測小鼠的執(zhí)行能力及工作記憶。在結束行為學測試后,每組小鼠各隨機地選取6只小鼠,用1%的戊巴比妥麻醉后,經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛,固定和解剖大腦組織。將每只小鼠大腦分為左右兩側腦半球,置于蔗糖水中進行梯度濃度的脫水,于冰凍切片機中用OCT包埋劑包埋腦組織后從頭側向尾側切取60μm厚的連續(xù)組織切片,對包含有MPFC結構的組織切片進行體視學抽樣分數(shù)為1/4的等距隨機抽樣,兩側腦半球可切取8組含有MPFC結構的連續(xù)等距切片。隨機抽取一組等距切片,進行甲苯胺藍尼氏染色,在體視學分析軟件里運用細胞構筑法定義并勾畫MPFC邊界,并運用卡瓦列里原理計算出各組小鼠的MPFC體積。余下的冰凍組織切片則經(jīng)過免疫組織化學染色和免疫熒光雙標等方法觀察MPFC內(nèi)Aβ斑塊的情況和p-Tau+(ser396)細胞的情況。并且在行為學測試后,每組小鼠各隨機選取6只小鼠進行麻醉,直接斷頸處死后,解剖出小鼠大腦并分離出MPFC,將MPFC勻漿后提蛋白檢測MPFC內(nèi)毒性Aβ40、毒性Aβ42、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)的表達。結果:1、體質量:FLX干預前,4組小鼠之間的體質量無顯著性差異;從FLX干預第一周起至FLX干預結束,每組小鼠的體質量干預前和干預后相比均無顯著性差異;FLX干預結束后,4組小鼠的體質量均無顯著性改變。2、曠場測試:在本研究中,FLX干預后,4組小鼠曠場試驗中的各項指標(包括曠場內(nèi)活動總路程,曠場中央路程,曠場中央路程百分比,曠場中央?yún)^(qū)活動時間,曠場活動時間百分比以及平均速度)均未見顯著性差異。3、水迷宮測試:4組小鼠的平均速度無顯著性差異。其中,AD+NS小鼠的逃避潛伏期較WT+NS小鼠的逃避潛伏期顯著性延長(p0.01),AD+FLX小鼠的逃避潛伏期與AD+NS小鼠的逃避潛伏期相比顯著性縮短(p0.05),AD+FLX小鼠的逃避潛伏期與WT+FLX小鼠的逃避潛伏期相比無顯著性差異;AD+NS小鼠穿越平臺次數(shù)與WT+NS小鼠相比顯著性減小(p0.01),AD+FLX小鼠穿越平臺次數(shù)較AD+NS小鼠顯著性增加(p0.05),4組小鼠的目標象限游泳的時間百分比無顯著性差異。4、Y迷宮測試結果:與WT+NS小鼠比較,AD+NS小鼠正確交替次數(shù)百分比顯著減少(p0.01);與AD+NS小鼠比較,AD+FLX正確交替次數(shù)百分比顯著增加(p0.01)。5、MPFC的體積計算結果:AD+NS小鼠的MPFC體積顯著小于WT+NS小鼠(p0.05),而氟西汀干預后,AD+FLX小鼠的MPFC體積顯著大于AD+NS小鼠(p0.01),AD+FLX小鼠和WT+FLX小鼠之間的MPFC體積則無顯著性差異。6、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ40和Aβ42的表達顯著大于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+NS組小鼠和AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ40沒有顯著性差異,AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ42的表達顯著低于AD+NS組小鼠(p0.01)。7、10月齡WT+NS組小鼠和WT+FLX組小鼠MPFC內(nèi)沒有老年斑沉積,而相同月齡AD+NS小鼠和AD+FLX小鼠MPFC內(nèi)均有少量的Aβ斑沉積,但AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)沉積的Aβ斑塊的大小和數(shù)量均要小于AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)沉積斑塊的大小和數(shù)量。8、AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-Tau+(ser396)細胞密度顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) p-Tau+(ser396)細胞密度顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.05)。ELISA結果顯示,10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-Tau蛋白表達顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),10月齡AD+FLX組MPFC內(nèi)p-Tau蛋白表達顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。結論:1、2個月的氟西汀干預可以顯著改善轉基因AD小鼠的空間學習記憶能力。2、10月齡的APP/PS1轉基因AD小鼠已出現(xiàn)工作記憶障礙,2個月的氟西汀干預可以延緩轉基因AD小鼠的工作記憶能力的減退。3、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)有Aβ斑塊沉積,并且不可溶毒性Aβ40和Aβ42表達顯著升高,而FLX治療可以減少老年斑的形成和降低Aβ42的表達從而減小MPFC的毒性反應。4、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表達顯著增加,而FLX治療可以減少p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表達水平從而減輕MPFC內(nèi)神經(jīng)原纖維的纏結。5、體視學精確定量研究發(fā)現(xiàn)10月齡的APP/PS1轉基因AD小鼠的MPFC體積存在顯著性萎縮,2個月的氟西汀干預可以延緩轉基因AD小鼠MPFC的萎縮。第二部分氟西汀對AD轉基因小鼠內(nèi)側前額葉皮質內(nèi)神經(jīng)元的作用及其可能機制研究目的:研究氟西汀(FLX)對處于剛發(fā)生行為學改變時的轉基因早期AD小鼠大腦內(nèi)側前額葉皮質內(nèi)神經(jīng)元的作用及其可能的作用機制研究,為尋求防治AD的干預新方法提供一定的實驗依據(jù)。方法:在第一部分行為學檢測結束后,獲得的8組含有MPFC結構的連續(xù)等距切片中,隨機抽取2組等距切片,運用免疫組織化學染色方法進行anti-DCX染色,運用體視學定量研究方法計算MPFC內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)目和DCX+神經(jīng)元細胞的數(shù)目,余下一組的等距切片則運用免疫熒光染色方法觀察MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元的情況以及海馬內(nèi)BrdU+/NeuN+新生神經(jīng)元的情況。結果:1、MPFC內(nèi)總神經(jīng)元數(shù)目的體視學定量結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.05),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05),AD+FLX組小鼠和WT+FLX組小鼠之間的MPFC神經(jīng)元總數(shù)目則無顯著性差異。2、MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元(未成熟神經(jīng)元)的體視學定量研究結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.01),WT+FLX組小鼠MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+FLX組小鼠(p0.05)。3、BrdU+/NeuN+神經(jīng)元(成熟的新生神經(jīng)元)免疫熒光的染色結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)BrdU+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)BrdU+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05)。4、5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元(5HT4R+/NeuN+細胞)免疫熒光的染色結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS 組小鼠(p0.05)。結論:1、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元顯著性丟失,FLX干預可以減少轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元的丟失。2、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)新生神經(jīng)元形成能力和存活能力均減弱,FLX干預可以促進轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)新生神經(jīng)元的形成和存活。3、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上5HT4R的表達顯著性降低,FLX干預可以增加轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上5HT4R的表達,提示FLX也許是通過增加或者激活5HT4R的表達來保護轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元的丟失和新生神經(jīng)元的形成和存活能力。第三部分氟西汀對AD轉基因小鼠內(nèi)側前額葉皮質內(nèi)突觸的作用及其可能機制研究目的:研究氟西汀干預對轉基因AD小鼠發(fā)生行為學改變的早期大腦內(nèi)側前額葉皮質內(nèi)突觸的作用及其可能的作用機制,為尋求防治AD的干預新方法提供一定的實驗數(shù)據(jù)。方法:在第一部分行為學檢測結束后,獲得的8組含有MPFC結構的連續(xù)等距切片中,隨機抽取2組等距切片,運用免疫金染色進行anti-spinophilin染色,運用現(xiàn)代體視學方法計算 MPFC內(nèi)樹突棘的數(shù)目,余下的一組等距切片則運用免疫熒光染色后觀察MPFC內(nèi)PSD95+突觸的情況以及5HT1AR+神經(jīng)元的情況。另外在第一部分行為學測試后每組小鼠各隨機選取6只小鼠進行麻醉,直接斷頸處死后解剖出小鼠大腦并分離出MPFC,將MPFC勻漿后提蛋白檢測MPFC內(nèi)突觸素(SYP)、GSK3β、p-ser9-GSK3β、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)元活性蛋白c-fos的表達情況。結果:1、MPFC內(nèi)spinophilin+樹突棘突觸的體視學定量結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)樹突棘突觸總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.05),而氟西汀干預后,AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)樹突棘突觸總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05),AD+FLX組小鼠和WT+FLX組小鼠之間的MPFC內(nèi)樹突棘突觸總數(shù)目則無顯著性差異。2、5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元免疫熒光的染色結果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05)。3、Anti-PSD95免疫熒光的染色結果:對單位面積內(nèi)PSD95+突觸的熒光強度進行定量后,AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)PSD95的表達顯著少于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠和AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)PSD95的表達無顯著性差異(p0.05)。4、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)SYP表達顯著低于相同月齡WT+NS 組小鼠(p0.01),10 月齡 AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) SYP 表達顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。5、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)GSK3β蛋白表達顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)GSK3β蛋白表達顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。并且,10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-ser9-GSK3β和β-catennin蛋白的表達與相同月齡WT+NS小鼠相比顯著性減少(p0.01,p0.01),AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) p-ser9-GSK3β 和 β-catennin 蛋白的表達與相同月齡AD+NS組小鼠相比顯著性增加(p0.01,p0.01)。6、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)c-fos表達顯著低于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)c-fos表達顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。7、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)BDNF表達顯著低于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)BDNF表達顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。結論:1、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC突觸顯著性丟失,FLX干預可以顯著地減少轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)突觸的丟失。2、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上的5HT1AR顯著減少,FLX干預可以提高轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上的5HT1AR表達水平。3、FLX激活經(jīng)典Wnt通路的關鍵分子可能是FLX保護MPFC內(nèi)突觸丟失的機制之一。4、10月齡時,APP/PS1轉基因AD小鼠MPFC內(nèi)BDNF和c-fos蛋白的表達顯著降低,而FLX治療可以增高BDNF和c-fos蛋白的表達。5、FLX也許是通過激活或增加5HT1AR來增強AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元興奮性和增加 BDNF的表達及神經(jīng)突觸的可塑性,減少突觸丟失,從而改善AD小鼠的認知功能障礙。
【圖文】：

在 450 納米波長下測得每孔的 OD 值 2.9 MPFC 的邊界劃分方法在 4 倍光學顯微鏡物鏡下，利用體視學分析軟件定義和勾畫出 MPFC 的邊界，體方法如下[76-77]：小鼠的 MPFC 主要由三個亞區(qū)構成，，即前緣皮層（PL） 下緣皮層（IL）以及扣帶回皮層（ACC） PL IL 以及 ACC 在組織結構和層次分化上表現(xiàn)為逐漸向側遷移，從個亞區(qū)排列的結構過渡到背側大腦皮質六層結構，第 IV 結構的缺失是其主要的特征 小鼠 MPFC 上邊界：區(qū)分點：SMI-32 染色中，運動皮層的深部各層次染色均 MPFC 深(圖 1 A)；尼氏染色中：Acd 和 PrCm (Fr2)之間的界限為在 PrCm (Fr2) VIa 和 VIb 之間有一薄層 細胞稀少的細胞帶，但是 ACd 的 V 層和 VI 層都不含亞細胞帶（圖 1 B）

重慶醫(yī)科大學博士研究生學位論文和 V 這條光亮的條帶終結于 MO 這種條帶分層在 PL 最為明顯，而在 MO 則不明顯 在 layerV，MO 的細胞排列成行，PL 則無此規(guī)律，MO 的細胞比 PL 小且密(圖 2 B)
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16

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本文編號：2689185