發(fā)布時(shí)間：2020-05-31 03:11

【摘要】：第一部分氟西汀對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)及內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)體積的作用目的:已有研究表明氟西汀能夠改善AD的認(rèn)知功能,但其機(jī)制仍不清楚。內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(MPFC)為AD受累的主要腦區(qū)之一,多項(xiàng)研究表明在阿爾茨海默病(AD)疾病的早期,一定比例的AD患者存在明顯的執(zhí)行功能障礙,而且AD患者會(huì)伴有顯著的與執(zhí)行功能障礙和相關(guān)的前額葉皮質(zhì)萎縮。因此,本研究主要探討氟西汀對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)、MPFC體積及其內(nèi)Aβ蛋白沉積和Tau蛋白磷酸化的作用。1[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81671259,81871073,81801269),重慶市首屆百名學(xué)術(shù)學(xué)科領(lǐng)軍人才培養(yǎng)資助經(jīng)費(fèi)(2012),the 2016 Supporting Innovation Projects of Graduate Students of Chongqing,and the 2016 Supporting Excellent Ph.D Projects of Chongqing Medical University.方法:選取40只8月齡的雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠,以及40只8月齡同窩生野生型小鼠。8月齡的AD轉(zhuǎn)基因小鼠被隨機(jī)分為AD生理鹽水組(AD+NS)和AD氟西汀組(AD+FLX),8月齡的同窩生野生型(WT)小鼠則分為野生型生理鹽水組(WT+NS)和野生型氟西汀組(WT+FLX)。給予AD+FLX組及WT+FLX組小鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg/d),持續(xù)2個(gè)月。同時(shí),給予相應(yīng)月齡AD+NS組及WT+NS組小鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。其中每組在氟西汀干預(yù)的第5周給予連續(xù)7天的BrdU腹腔注射(50mg/kg/d)。每周均檢測(cè)4組小鼠的體質(zhì)量。為期2個(gè)月的干預(yù)后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行曠場(chǎng)測(cè)試,以檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力和焦慮樣行為;運(yùn)用Morris水迷宮測(cè)試小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力;運(yùn)用Y迷宮檢測(cè)小鼠的執(zhí)行能力及工作記憶。在結(jié)束行為學(xué)測(cè)試后,每組小鼠各隨機(jī)地選取6只小鼠,用1%的戊巴比妥麻醉后,經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛,固定和解剖大腦組織。將每只小鼠大腦分為左右兩側(cè)腦半球,置于蔗糖水中進(jìn)行梯度濃度的脫水,于冰凍切片機(jī)中用OCT包埋劑包埋腦組織后從頭側(cè)向尾側(cè)切取60μm厚的連續(xù)組織切片,對(duì)包含有MPFC結(jié)構(gòu)的組織切片進(jìn)行體視學(xué)抽樣分?jǐn)?shù)為1/4的等距隨機(jī)抽樣,兩側(cè)腦半球可切取8組含有MPFC結(jié)構(gòu)的連續(xù)等距切片。隨機(jī)抽取一組等距切片,進(jìn)行甲苯胺藍(lán)尼氏染色,在體視學(xué)分析軟件里運(yùn)用細(xì)胞構(gòu)筑法定義并勾畫(huà)MPFC邊界,并運(yùn)用卡瓦列里原理計(jì)算出各組小鼠的MPFC體積。余下的冰凍組織切片則經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光雙標(biāo)等方法觀察MPFC內(nèi)Aβ斑塊的情況和p-Tau+(ser396)細(xì)胞的情況。并且在行為學(xué)測(cè)試后,每組小鼠各隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行麻醉,直接斷頸處死后,解剖出小鼠大腦并分離出MPFC,將MPFC勻漿后提蛋白檢測(cè)MPFC內(nèi)毒性Aβ40、毒性Aβ42、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)的表達(dá)。結(jié)果:1、體質(zhì)量:FLX干預(yù)前,4組小鼠之間的體質(zhì)量無(wú)顯著性差異;從FLX干預(yù)第一周起至FLX干預(yù)結(jié)束,每組小鼠的體質(zhì)量干預(yù)前和干預(yù)后相比均無(wú)顯著性差異;FLX干預(yù)結(jié)束后,4組小鼠的體質(zhì)量均無(wú)顯著性改變。2、曠場(chǎng)測(cè)試:在本研究中,FLX干預(yù)后,4組小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)中的各項(xiàng)指標(biāo)(包括曠場(chǎng)內(nèi)活動(dòng)總路程,曠場(chǎng)中央路程,曠場(chǎng)中央路程百分比,曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間,曠場(chǎng)活動(dòng)時(shí)間百分比以及平均速度)均未見(jiàn)顯著性差異。3、水迷宮測(cè)試:4組小鼠的平均速度無(wú)顯著性差異。其中,AD+NS小鼠的逃避潛伏期較WT+NS小鼠的逃避潛伏期顯著性延長(zhǎng)(p0.01),AD+FLX小鼠的逃避潛伏期與AD+NS小鼠的逃避潛伏期相比顯著性縮短(p0.05),AD+FLX小鼠的逃避潛伏期與WT+FLX小鼠的逃避潛伏期相比無(wú)顯著性差異;AD+NS小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)與WT+NS小鼠相比顯著性減小(p0.01),AD+FLX小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)較AD+NS小鼠顯著性增加(p0.05),4組小鼠的目標(biāo)象限游泳的時(shí)間百分比無(wú)顯著性差異。4、Y迷宮測(cè)試結(jié)果:與WT+NS小鼠比較,AD+NS小鼠正確交替次數(shù)百分比顯著減少(p0.01);與AD+NS小鼠比較,AD+FLX正確交替次數(shù)百分比顯著增加(p0.01)。5、MPFC的體積計(jì)算結(jié)果:AD+NS小鼠的MPFC體積顯著小于WT+NS小鼠(p0.05),而氟西汀干預(yù)后,AD+FLX小鼠的MPFC體積顯著大于AD+NS小鼠(p0.01),AD+FLX小鼠和WT+FLX小鼠之間的MPFC體積則無(wú)顯著性差異。6、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ40和Aβ42的表達(dá)顯著大于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+NS組小鼠和AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ40沒(méi)有顯著性差異,AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)不可溶的毒性Aβ42的表達(dá)顯著低于AD+NS組小鼠(p0.01)。7、10月齡WT+NS組小鼠和WT+FLX組小鼠MPFC內(nèi)沒(méi)有老年斑沉積,而相同月齡AD+NS小鼠和AD+FLX小鼠MPFC內(nèi)均有少量的Aβ斑沉積,但AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)沉積的Aβ斑塊的大小和數(shù)量均要小于AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)沉積斑塊的大小和數(shù)量。8、AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-Tau+(ser396)細(xì)胞密度顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) p-Tau+(ser396)細(xì)胞密度顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.05)。ELISA結(jié)果顯示,10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-Tau蛋白表達(dá)顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),10月齡AD+FLX組MPFC內(nèi)p-Tau蛋白表達(dá)顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。結(jié)論:1、2個(gè)月的氟西汀干預(yù)可以顯著改善轉(zhuǎn)基因AD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。2、10月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠已出現(xiàn)工作記憶障礙,2個(gè)月的氟西汀干預(yù)可以延緩轉(zhuǎn)基因AD小鼠的工作記憶能力的減退。3、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)有Aβ斑塊沉積,并且不可溶毒性Aβ40和Aβ42表達(dá)顯著升高,而FLX治療可以減少老年斑的形成和降低Aβ42的表達(dá)從而減小MPFC的毒性反應(yīng)。4、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表達(dá)顯著增加,而FLX治療可以減少p-Tau蛋白和p-Tau+(ser396)的表達(dá)水平從而減輕MPFC內(nèi)神經(jīng)原纖維的纏結(jié)。5、體視學(xué)精確定量研究發(fā)現(xiàn)10月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠的MPFC體積存在顯著性萎縮,2個(gè)月的氟西汀干預(yù)可以延緩轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC的萎縮。第二部分氟西汀對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的作用及其可能機(jī)制研究目的:研究氟西汀(FLX)對(duì)處于剛發(fā)生行為學(xué)改變時(shí)的轉(zhuǎn)基因早期AD小鼠大腦內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元的作用及其可能的作用機(jī)制研究,為尋求防治AD的干預(yù)新方法提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:在第一部分行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,獲得的8組含有MPFC結(jié)構(gòu)的連續(xù)等距切片中,隨機(jī)抽取2組等距切片,運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行anti-DCX染色,運(yùn)用體視學(xué)定量研究方法計(jì)算MPFC內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)目和DCX+神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)目,余下一組的等距切片則運(yùn)用免疫熒光染色方法觀察MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元的情況以及海馬內(nèi)BrdU+/NeuN+新生神經(jīng)元的情況。結(jié)果:1、MPFC內(nèi)總神經(jīng)元數(shù)目的體視學(xué)定量結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.05),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05),AD+FLX組小鼠和WT+FLX組小鼠之間的MPFC神經(jīng)元總數(shù)目則無(wú)顯著性差異。2、MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元(未成熟神經(jīng)元)的體視學(xué)定量研究結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.01),WT+FLX組小鼠MPFC內(nèi)DCX+神經(jīng)元總數(shù)目顯著大于AD+FLX組小鼠(p0.05)。3、BrdU+/NeuN+神經(jīng)元(成熟的新生神經(jīng)元)免疫熒光的染色結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)BrdU+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠MPFC內(nèi)BrdU+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05)。4、5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元(5HT4R+/NeuN+細(xì)胞)免疫熒光的染色結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)5HT4R+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS 組小鼠(p0.05)。結(jié)論:1、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元顯著性丟失,FLX干預(yù)可以減少轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元的丟失。2、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)新生神經(jīng)元形成能力和存活能力均減弱,FLX干預(yù)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)新生神經(jīng)元的形成和存活。3、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上5HT4R的表達(dá)顯著性降低,FLX干預(yù)可以增加轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上5HT4R的表達(dá),提示FLX也許是通過(guò)增加或者激活5HT4R的表達(dá)來(lái)保護(hù)轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元的丟失和新生神經(jīng)元的形成和存活能力。第三部分氟西汀對(duì)AD轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)突觸的作用及其可能機(jī)制研究目的:研究氟西汀干預(yù)對(duì)轉(zhuǎn)基因AD小鼠發(fā)生行為學(xué)改變的早期大腦內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)內(nèi)突觸的作用及其可能的作用機(jī)制,為尋求防治AD的干預(yù)新方法提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法:在第一部分行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,獲得的8組含有MPFC結(jié)構(gòu)的連續(xù)等距切片中,隨機(jī)抽取2組等距切片,運(yùn)用免疫金染色進(jìn)行anti-spinophilin染色,運(yùn)用現(xiàn)代體視學(xué)方法計(jì)算 MPFC內(nèi)樹(shù)突棘的數(shù)目,余下的一組等距切片則運(yùn)用免疫熒光染色后觀察MPFC內(nèi)PSD95+突觸的情況以及5HT1AR+神經(jīng)元的情況。另外在第一部分行為學(xué)測(cè)試后每組小鼠各隨機(jī)選取6只小鼠進(jìn)行麻醉,直接斷頸處死后解剖出小鼠大腦并分離出MPFC,將MPFC勻漿后提蛋白檢測(cè)MPFC內(nèi)突觸素(SYP)、GSK3β、p-ser9-GSK3β、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)元活性蛋白c-fos的表達(dá)情況。結(jié)果:1、MPFC內(nèi)spinophilin+樹(shù)突棘突觸的體視學(xué)定量結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)樹(shù)突棘突觸總數(shù)目顯著小于WT+NS組小鼠(p0.05),而氟西汀干預(yù)后,AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)樹(shù)突棘突觸總數(shù)目顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05),AD+FLX組小鼠和WT+FLX組小鼠之間的MPFC內(nèi)樹(shù)突棘突觸總數(shù)目則無(wú)顯著性差異。2、5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元免疫熒光的染色結(jié)果:AD+NS組小鼠的MPFC內(nèi)5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著小于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠的MPFC內(nèi)5HT1AR+/NeuN+神經(jīng)元密度顯著大于AD+NS組小鼠(p0.05)。3、Anti-PSD95免疫熒光的染色結(jié)果:對(duì)單位面積內(nèi)PSD95+突觸的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量后,AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)PSD95的表達(dá)顯著少于WT+NS組小鼠(p0.01),而AD+FLX組小鼠和AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)PSD95的表達(dá)無(wú)顯著性差異(p0.05)。4、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)SYP表達(dá)顯著低于相同月齡WT+NS 組小鼠(p0.01),10 月齡 AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) SYP 表達(dá)顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。5、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)GSK3β蛋白表達(dá)顯著高于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)GSK3β蛋白表達(dá)顯著低于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。并且,10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)p-ser9-GSK3β和β-catennin蛋白的表達(dá)與相同月齡WT+NS小鼠相比顯著性減少(p0.01,p0.01),AD+FLX 組 MPFC 內(nèi) p-ser9-GSK3β 和 β-catennin 蛋白的表達(dá)與相同月齡AD+NS組小鼠相比顯著性增加(p0.01,p0.01)。6、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)c-fos表達(dá)顯著低于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)c-fos表達(dá)顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。7、10月齡AD+NS組小鼠MPFC內(nèi)BDNF表達(dá)顯著低于相同月齡WT+NS組小鼠(p0.01),AD+FLX組MPFC內(nèi)BDNF表達(dá)顯著高于相同月齡AD+NS組小鼠(p0.01)。結(jié)論:1、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC突觸顯著性丟失,FLX干預(yù)可以顯著地減少轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)突觸的丟失。2、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上的5HT1AR顯著減少,FLX干預(yù)可以提高轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元上的5HT1AR表達(dá)水平。3、FLX激活經(jīng)典Wnt通路的關(guān)鍵分子可能是FLX保護(hù)MPFC內(nèi)突觸丟失的機(jī)制之一。4、10月齡時(shí),APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠MPFC內(nèi)BDNF和c-fos蛋白的表達(dá)顯著降低,而FLX治療可以增高BDNF和c-fos蛋白的表達(dá)。5、FLX也許是通過(guò)激活或增加5HT1AR來(lái)增強(qiáng)AD小鼠MPFC內(nèi)神經(jīng)元興奮性和增加 BDNF的表達(dá)及神經(jīng)突觸的可塑性,減少突觸丟失,從而改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙。
【圖文】：

在 450 納米波長(zhǎng)下測(cè)得每孔的 OD 值 2.9 MPFC 的邊界劃分方法在 4 倍光學(xué)顯微鏡物鏡下，利用體視學(xué)分析軟件定義和勾畫(huà)出 MPFC 的邊界，體方法如下[76-77]：小鼠的 MPFC 主要由三個(gè)亞區(qū)構(gòu)成，，即前緣皮層（PL） 下緣皮層（IL）以及扣帶回皮層（ACC） PL IL 以及 ACC 在組織結(jié)構(gòu)和層次分化上表現(xiàn)為逐漸向側(cè)遷移，從個(gè)亞區(qū)排列的結(jié)構(gòu)過(guò)渡到背側(cè)大腦皮質(zhì)六層結(jié)構(gòu)，第 IV 結(jié)構(gòu)的缺失是其主要的特征 小鼠 MPFC 上邊界：區(qū)分點(diǎn)：SMI-32 染色中，運(yùn)動(dòng)皮層的深部各層次染色均 MPFC 深(圖 1 A)；尼氏染色中：Acd 和 PrCm (Fr2)之間的界限為在 PrCm (Fr2) VIa 和 VIb 之間有一薄層 細(xì)胞稀少的細(xì)胞帶，但是 ACd 的 V 層和 VI 層都不含亞細(xì)胞帶（圖 1 B）

重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文和 V 這條光亮的條帶終結(jié)于 MO 這種條帶分層在 PL 最為明顯，而在 MO 則不明顯 在 layerV，MO 的細(xì)胞排列成行，PL 則無(wú)此規(guī)律，MO 的細(xì)胞比 PL 小且密(圖 2 B)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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