【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病,其原因和發(fā)病機制至今未明。β淀粉樣蛋白(amyloid proteinβ, Aβ)的神經(jīng)毒作用是導(dǎo)致AD的共同通路,大量研究表明Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是AD發(fā)病的重要病理生理學(xué)機制。 細(xì)胞膜氯通道的激活可能是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要離子機制,本實驗利用氯通道的阻斷劑DIDS和Phloretin研究Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡這一AD模型中氯通道的作用。 JNK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)中重要的通路之一,是參與應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制,本實驗初探Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡過程中是否有JNK蛋白的磷酸化激活,以及氯通道阻斷劑DIDS和Phloretin與JNK的磷酸化激活的關(guān)系。 由于Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的機制十分復(fù)雜,至今尚未找到可以抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性靶點。因此,闡明機制找到靶點,將為AD的防治帶來希望。 目的: 1.觀察氯通道阻斷劑DIDS能否抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,了解氯通道在Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡過程中的作用。 2.觀察對VSOR Cl-通道有相對特異性阻斷作用的Phloretin能否抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,從而了解VSOR Cl-通道是否參與下調(diào)Aβ毒性作用。 3.探討JNK在Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡中的作用,以及氯通道阻斷劑與JNK的關(guān)系。 方法: 1.以傳代培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為研究對象,實驗設(shè)立陰性組(正常對照組),陽性對照組(僅給Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡處理),及實驗組(Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡+氯通道阻斷劑DIDS或Phloretin)。 2.噻唑蘭(3-( 4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)比色法觀察PC12細(xì)胞存活率;用熒光顯微鏡觀察Hoechst33258熒光染色后的細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化;采用熒光素檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平,反映PC12細(xì)胞膜完整性的改變;DNA瓊脂糖凝膠電泳,檢測PC12細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 3.采用Western Blot印跡法檢測Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡時不同時間點P-JNK的表達(dá)和不同處理組P-JNK的表達(dá)。 4.所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。 結(jié)果: 1.實驗結(jié)果驗證了Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞時細(xì)胞發(fā)生凋亡。并且發(fā)現(xiàn)DIDS和Phloretin能夠有效地抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。 2. 40μmol/L Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞(作用24 h)后,MTT實驗顯示細(xì)胞存活率(58.4 %±9.3 %)降低,與陽性對照組相比細(xì)胞存活率在Aβ25-35+DIDS組(86.0%±7.2%)或Aβ25-35+ Phloretin組(94.1%±9.3%),均有增加,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。 3. Hoechst33258熒光染色顯示Aβ25-35作用于PC12細(xì)胞時,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮,胞核染色質(zhì)斷裂、聚集、固縮等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,而實驗組凋亡細(xì)胞明顯減少。 4. LDH釋放水平:陰性組與Aβ25-35陽性對照組(433.1±41.5 U/L)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01);Aβ25-35陽性對照組與Aβ25-35+Phloretin實驗組(354.4±34.3 U/L)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01);Aβ25-35陽性對照組與Aβ25-35 +DIDS實驗組(366.7±28.3 U/L),比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。 5. DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:Aβ25-35陽性組可以見到明顯的DNA“梯帶”,陰性組和實驗組沒有DNA“梯帶”。 6. Western Blot印跡結(jié)果:6 h時Aβ25-35誘導(dǎo)PC12 P-JNK蛋白表達(dá)量增高,與0 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。兩個實驗組與陽性對照組比較,P-JNK蛋白表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P 0.01)。 結(jié)論: 本研究表明:氯通道阻斷劑DIDS和Phloretin可以抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,而且,應(yīng)用氯通道阻斷劑可使P-JNK表達(dá)降低。因相對特異性的VSOR Cl-通道阻斷劑Phloretin可以對Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用,從而推測VSOR Cl-通道在Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡時可能被激活。且推測氯通道阻斷劑對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的下調(diào)作用是通過抑制JNK磷酸化實現(xiàn)的。
【圖文】：

圖1 MTT比色法檢測Phloretin對細(xì)胞存活率的影響Fig.1 The effect of Phloretin on cell viability圖2 MTT比色法檢測DIDS對細(xì)胞存活率的影響Fig 2. The effect of DIDS on cell viability

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖3 不同處理組的LDH活力測定Fig.3 The levels of LDH in different groups3.3 Hoechst 33258 染色Hoechst33258 熒光染色顯示 Aβ 損傷組 PC12 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮，胞核染色質(zhì)斷裂、聚集、固縮等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化；有明顯的典型 DNA“梯狀”條帶等生化改變。Aβ+Ploretin 組和 Aβ+DIDS 組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化少見。而對照組的細(xì)胞則無典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。（見圖 4）圖4 Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡(×200，，實心箭頭示凋亡細(xì)胞)-35-
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R749.161

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本文編號：2685083