【摘要】：抑郁癥是一種以情緒低落、興趣缺乏、思維遲緩、無價值感和負(fù)罪感等主要臨床特征的慢性精神障礙疾病,常伴有食欲不振、疲勞感增加、失眠、注意力不集中等癥狀。它具有高患病率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高自殺率等特點(diǎn)。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。一般認(rèn)為其與遺傳、生物化學(xué)、內(nèi)分泌、免疫、社會心理、文化等多種因素有關(guān)。目前,臨床上對抑郁癥的診斷主要依賴于醫(yī)師通過使用量表對患者的癥狀表現(xiàn)進(jìn)行診斷評估。然而,這種診斷方法受臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)及患者自身的主觀因素等影響,導(dǎo)致不能對抑郁癥進(jìn)行準(zhǔn)確有效地識別,并不能準(zhǔn)確有效的診斷抑郁癥。因此,我們通過代謝組學(xué)的方法尋找抑郁癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物不僅有利于揭示其病理機(jī)制,還為抑郁癥的早期診斷和預(yù)后提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外,近年來研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,且腸道菌群影響宿主的代謝表型,參與了宿主的共代謝過程,這種共代謝關(guān)系對于維持宿主的生理健康有著重要意義。然而目前對抑郁癥與腸道菌群關(guān)系的研究多建立在動物模型上。因此,我們研究了抑郁癥患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化如何影響其代謝表型,從而揭示腸道菌群參與抑郁癥整體代謝的病理生理機(jī)制。另一方面,臨床上使用的抗抑郁藥物具有一定程度的副作用、有效治愈率不高,且患者對藥物存在明顯的個體差異性,導(dǎo)致臨床治療效果不佳,故而尋找副作用小,治療效果好的有效藥物成為研究熱點(diǎn)。因此,本課題首先基于超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS)技術(shù),采用代謝組學(xué)的研究方法對一批臨床抑郁癥患者的血清和尿液分別進(jìn)行了研究,篩選和挖掘與抑郁癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物;接著利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)并結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對抑郁癥患者糞便細(xì)菌16S rDNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行全面分析,探索抑郁癥患者腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)多樣性特征,并找出與疾病相關(guān)的細(xì)菌物種;并在此研究的基礎(chǔ)上,研究腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化對抑郁癥代謝表型可能產(chǎn)生的影響;然后通過本課題組的天然產(chǎn)物活性篩選平臺得到了一個具有較好抗抑郁活性的皂苷類化合物Bacopaside Ⅰ,結(jié)合代謝組學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段對其抗抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行了深入探索。具體研究內(nèi)容如下:1、基于UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)對抑郁癥患者和健康對照組的血清和尿液樣本分別進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。研究結(jié)果顯示,在正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的多元統(tǒng)計(jì)得分圖上顯示抑郁癥患者的血清與尿液樣本均與健康對照組存在明顯的分類趨勢,結(jié)合單變量的統(tǒng)計(jì)分析方法分別篩選到了50個和75個與抑郁癥相關(guān)的血清和尿液的差異代謝物。利用MetaboAnalyst軟件通過對這些差異代謝物涉及的代謝通路進(jìn)行富集分析,發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清的代謝物異常主要表現(xiàn)在甘油磷脂代謝、膽汁酸生物合成代謝、鞘脂代謝等途徑;而尿液的差異代謝物主要涉及精氨酸和脯氨酸代謝、咖啡因代謝、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、嘌呤代謝、氨�；�-tRNA生物合成以及賴氨酸生物合成等代謝異常。此外,基于二元logistic回歸模型篩選到12個AUC大于0.9的血清代謝物,進(jìn)一步繪制了其中4個肉堿類代謝物作為生物標(biāo)志物群構(gòu)建的ROC曲線,其ROC曲線下面積為0.991,敏感度為96.5%,特異性為93%。同理,我們在尿液差異代謝物篩選到4個AUC大于0.8的代謝物,其作為生物標(biāo)志物群構(gòu)建的ROC曲線面積為0.897,敏感度為86%,特異性為84.2%。以上研究為進(jìn)一步理解抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及日后臨床的早期診斷與篩查提供了基礎(chǔ)。2、接下來,采用Illumina MiSeq高通量測序方法對抑郁癥患者和健康人群腸道菌群多樣性結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了全面分析。盡管兩類人群的糞便菌群存在明顯的個體差異,但抑郁癥病人腸道菌群的多樣性和豐富度與對照人群無明顯差異,其主要優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門,且厚壁菌門/擬桿菌門的豐度比值在抑郁癥患者中顯著增加。Beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者與健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯的差異,進(jìn)一步研究表明這一腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡的主要特征是一些條件致病菌或潛在致病菌屬的豐度顯著增加,而對腸道有益的產(chǎn)丁酸鹽菌和抗炎性菌屬的豐度明顯減少。這些菌群變化可能在抑郁癥發(fā)生發(fā)展過程中起到一定的作用。本研究從腸道微生態(tài)的角度豐富了抑郁癥的病因?qū)W理論,為今后以腸道菌群為靶點(diǎn),優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu),從而為預(yù)防和治療抑郁癥奠定了基礎(chǔ)。3、在前面1-2部分研究的基礎(chǔ)上,通過Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算的方法對抑郁癥血清和尿液篩選的差異代謝物與16S rDNA基因高通量測序得到的腸道菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑郁癥患者腸道內(nèi)產(chǎn)SCFA的細(xì)菌菌屬與涉及能量代謝、膽汁酸代謝、氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝的代謝物存在相關(guān)性,提示我們腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)可能影響這些代謝途徑,進(jìn)而影響了宿主的代謝表型,這為我們進(jìn)一步探討腸道菌群參與抑郁癥患者整體代謝的病理生理機(jī)制提供了參考。4、利用國際公認(rèn)的慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)方法誘導(dǎo)的抑郁癥小鼠模型評價Bacopaside Ⅰ的抗抑郁作用。研究結(jié)果顯示,通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bacopaside Ⅰ能顯著升高CUMS小鼠蔗糖溶液攝入量,明顯減少CUMS小鼠在懸尾、強(qiáng)迫游泳中不動時間,但對小鼠無中樞興奮性作用,這提示Bacopaside Ⅰ對CUMS小鼠抑郁行為具有良好的改善作用。ELISA、RT-qPCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示Bacopaside Ⅰ能顯著降低CUMS小鼠血漿中皮質(zhì)酮的含量,Bacopaside Ⅰ能提高CUMS小鼠海馬和前額組織中GR和BDNF mRNA的表達(dá)量,上調(diào)海馬和前額部位GR、BDNF、pERK和pCREB蛋白的表達(dá)。這提示Bacopaside Ⅰ可能是通過調(diào)節(jié)HPA軸的過度活躍以及激活海馬和前額組織中的BDNF信號途徑來產(chǎn)生抗抑郁作用的。其次,利用基于UPLC-Q/TOF-MS的技術(shù)對上述給予高劑量的Bacopaside Ⅰ的小鼠血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析,進(jìn)一步探討B(tài)acopaside Ⅰ對抑郁癥小鼠整體代謝譜的影響及其相關(guān)的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示,模型組小鼠與正常組、藥物干預(yù)組與模型組小鼠的血漿譜均存在顯著性差異,利用多變量和單變量的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,我們共鑒定了35個與CUMS模型以及藥物干預(yù)相關(guān)的差異代謝物。其中,與模型組小鼠相比,Bacopaside Ⅰ調(diào)控了19個內(nèi)源性代謝物,氟西汀調(diào)控了26個內(nèi)源性代謝物,Bacopaside Ⅰ和氟西汀同時調(diào)控了15個內(nèi)源性代謝物。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CUMS誘導(dǎo)的抑郁小鼠在甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、氨基酸代謝以及氧化應(yīng)激等方面發(fā)生了失調(diào),氟西汀和Bacopaside Ⅰ可能是通過調(diào)控這些紊亂的代謝途徑從而產(chǎn)生抗抑郁效應(yīng)的。綜上所述,本課題利用基于UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)篩選了與抑郁癥患者血清和尿液相關(guān)的內(nèi)源性差異代謝物,分析了與抑郁癥致病機(jī)制相關(guān)的異常代謝通路,從整體層面揭示了與抑郁癥相關(guān)的病理機(jī)制;接著利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)研究了抑郁癥患者腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)多樣性特征,找出與疾病相關(guān)的細(xì)菌物種;并在此研究的基礎(chǔ)上,研究了抑郁癥患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化是如何影響其代謝表型的,從而揭示了腸道菌群參與抑郁癥整體代謝的病理生理機(jī)制,對今后診斷和治療抑郁癥具有重要意義。另外,利用本課題組的天然藥物活性篩選平臺和基于分子生物學(xué)及代謝組學(xué)的方法對篩選到的天然產(chǎn)物Bacopaside Ⅰ的抗抑郁作用機(jī)制進(jìn)行了探索,闡明了Bacopaside Ⅰ治療抑郁癥的相關(guān)作用途徑和機(jī)制,這些結(jié)果為進(jìn)一步尋找新穎有效的抗抑郁藥物提供了新的思路。
【圖文】：

抑郁癥患者代謝組與腸道菌群結(jié)構(gòu)特征分析及 Bacopaside I 抗抑郁作用的機(jī)統(tǒng)生物學(xué)的一個分支，是繼基因組學(xué)（genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcript組學(xué)（proteomics）后新發(fā)展起來的一種組學(xué)技術(shù)，已在疾病診斷、藥物全等研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢[56-58]。與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)不同的告訴我們生物體系已經(jīng)發(fā)生了什么，最能客觀反映生物體最終的代謝狀學(xué)的重要補(bǔ)充[59]。（二）代謝組學(xué)的研究策略謝組學(xué)研究的基本研究方法主要包括以下幾個方面：生物樣本的選擇和處理、代謝物檢測分析、采集的數(shù)據(jù)預(yù)處理、多元統(tǒng)計(jì)分析、生物標(biāo)志志物的生物學(xué)意義闡明�；痉治隽鞒虉D如圖 1-1。

圖 1-2 宿主、環(huán)境及腸道菌群相互作用影響人體健康及疾病Figure 1-2 Effect of interactions among the host, environment and gut microbiotain human health and diseases（四）腸道菌群的檢測方法為了研究腸道菌群的種類及其生物學(xué)功能，各國研究者利用各種方法對其成員組成和功能進(jìn)行了大量的工作。傳統(tǒng)的研究方法主要是通過選擇性細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)對培養(yǎng)的微生物進(jìn)行鑒定，該方法耗時、費(fèi)力、繁瑣。然而，由于腸道內(nèi)大多數(shù)細(xì)菌特殊的生長環(huán)境，，很難選擇合適的培養(yǎng)基和控制嚴(yán)格的厭氧條件，導(dǎo)致絕大多數(shù)微生物難以分離培養(yǎng)，這在很大程度上限制了我們對腸道菌群的認(rèn)識。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及其在腸道菌群中的應(yīng)用，越來越多的研究者們采用不依賴于純培養(yǎng)的方法來研究腸道菌群，從而大大擴(kuò)展了對腸道菌群的鑒別能力，也更加客觀、快速、全面地分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成。常用的微生物分子生態(tài)學(xué)分析技術(shù)可以分為兩大類：①基于 DNA 指紋圖譜技術(shù)，常用的主要包括變性梯度凝膠電泳技術(shù)、溫度梯度凝膠電泳技術(shù)、時相溫度梯度凝膠電泳技術(shù)、末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)、腸桿
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.4

【參考文獻(xiàn)】

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