【摘要】： 前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是發(fā)生在老年人群的一種以進行性癡呆和情感障礙為臨床特征的神經退行性疾病。AD最主要的病理學特征是細胞外出現大量的以β-淀粉樣蛋白(amyloid-βprotein, Aβ)為主要組成成分的老年斑。Ap是由淀粉樣肽前體蛋白(amyloid-βprecursor protein, APP)經分泌酶剪切產生。APP的外功能區(qū)首先由β-分泌酶剪切并產生一個APP C-端片段,此片段進一步由γ-分泌酶復合體在其跨膜區(qū)域進行剪切,進而形成Aβ多肽。APP以及它的蛋白水解產物Aβ都是金屬蛋白,分子上有鋅結合位點,鋅離子與這些蛋白結構的穩(wěn)定性密切相關。近年來研究發(fā)現在AD患者的大腦以及轉基因小鼠大腦Aβ老年斑內有大量鋅離子沉積,鋅離子通過調節(jié)mRNA的5'-UTR來促進APP的表達,更重要的是體外實驗證明鋅離子通過共價鍵與相鄰兩條Aβ分子第13位上的組氨酸結合,從而使Aβ聚合并形成纖維狀沉積。此外,鋅螯合劑CQ、DP-109等都可以降低腦內鋅含量,改善AD病人的認知功能狀態(tài),抑制AD轉基因小鼠大腦內老年斑的形成。綜上可見,AD腦中鋅含量的異常可能是導致Aβ積聚的一個重要因素,改善鋅代謝紊亂可能是治療AD的一個潛在策略。在動物在體水平,鋅離子對AD發(fā)病的病理過程及老年斑形成的影響機制目前尚無詳細報道。因此,本研究以AD模型小鼠-APP/PS1轉基因小鼠做為實驗對象,分別用鋅離子和鋅螯合劑氯碘羥喹(clioquinol, CQ)處理動物,結合行為學、形態(tài)學和分子生物學等手段,檢測鋅離子對APP/PS1小鼠的學習記憶能力、腦內老年斑形成、APP蛋白及其酶切產物以及Aβ分泌的影響,揭示鋅離子參與AD病理生理過程的分子機制。 材料與方法 42只3月齡健康雄性C57BL／6小鼠,隨機均分為3組：(1)正常對照組；(2)溶劑對照組：腹腔注射等量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO); (3) CQ組：腹腔注射CQ (Sigma, 100mg/kg,用DMSO溶解為1％的儲存液)。斷頭取腦,做TSQ熒光探針染色和金屬自顯影技術(AMG)組織化學染色。 48只3月齡雄性APP／PS1轉基因鼠隨機均分為4組：(1)正常對照組；(2)高鋅組(喂飼含ZnSO4的水,濃度20mg/ml); (3)鋅+CQ組(喂飼含ZnSO4的水,濃度20mg/ml,至7月齡時管飼法給予20mg／kg的CQ)；(4)CQ組(7月齡時管飼法給予20mg／kg的CQ)。每天記錄一次體重變化。當小鼠到9月齡時,做Morris水迷宮實驗,檢測各組小鼠的學習記憶能力。隨后心臟取血并分離血清,進行原子吸收光譜檢測,分析各組小鼠血清鋅的變化。斷頭取腦,大腦左半球固定做冰凍切片,右半球分離皮層和海馬,做分子生物學檢測。應用AMG和免疫組織化學技術檢測各組小鼠腦內Aβ老年斑的變化；應用Western Blot技術檢測各組小鼠大腦皮層APP、ADAM10、BACE1、PS1、sAPPα、sAPPβ蛋白表達的變化；應用ELISA技術檢測Aβ在各組小鼠大腦皮層的含量。 實驗結果 1.CQ對鋅離子螯合作用的檢測 腹腔注射CQ組小鼠大腦鋅離子的TSQ熒光探針染色和AMG組織化學染色均明顯低于正常對照組和溶劑對照組,而溶劑對照組和正常對照組之間沒有明顯差異。 2.鋅離子致轉基因鼠體重及血清鋅、腦鋅含量的變化 與對照組相比,給鋅組轉基因鼠的體重顯著下降,毛色變棕黃,血清鋅、腦鋅含量顯著增高。鋅螯合劑CQ能逆轉鋅對APP/PS1轉基因鼠的毒性作用,但是其自身對轉基因鼠的膚色和體重沒有影響。 3.鋅離子對轉基因鼠學習記憶能力的影響 與對照組相比,給鋅組轉基因鼠的學習記憶能力和空間探索能力均顯著降低,而鋅螯合劑CQ能一定程度改善高鋅喂養(yǎng)對APP/PS1轉基因鼠學習記憶能力的影響,并且其本身也能顯著改善APP/PS1轉基因鼠的認知能力。 4.鋅離子對轉基因鼠腦內老年斑形成的影響 與對照組相比,給鋅組轉基因鼠的大腦皮層、海馬的老年斑塊明顯增多。鋅螯合劑CQ能減緩鋅對老年斑形成的促進作用,CQ本身亦能顯著降低轉基因鼠腦內老年斑的數量。 5.鋅離子對轉基因鼠腦內APP蛋白及其分解酶、分解產物表達的影響 與對照組相比,給鋅組轉基因鼠腦內APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達明顯增多,Aβ含量明顯增加,ADAM10和sAPPa表達下降；CQ組轉基因鼠腦內APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達和可溶性Aβ含量減少,ADAM10和sAPPa蛋白表達明顯增強。 結論 1.CQ對游離鋅離子有明顯的螯合作用。 2.高鋅使APP/PS1轉基因鼠的體重下降,血清鋅、腦鋅含量升高。 3.高鋅使APP/PS1轉基因鼠的認知能力顯著下降。 4.高鋅能促進APP/PS1轉基因鼠腦內老年斑的生成。 5.高鋅能影響APP/PS1轉基因鼠腦內APP、APP代謝酶及其產物表達。
【圖文】：

AMG組織化學染色顯示大腦Cx(皮層)，海馬CA3區(qū)、DG(齒狀回)游離鋅離子分布。注:**P<0.ol，““六0.01。3、鋅離子致轉基因鼠體重及血清鋅、腦鋅含量的變化，川一洲丁對一照紅}_{州比，高鋅喂介糾APP/P51轉J間川鼠從:‘、){齡始j主漸仁色發(fā)位，體幣j、一l二羊(圖3A)，全!J九月齡[l、J，體重l叼{:;!低J幾l卜‘}、，了、j照了11(尸<。.()5)({冬{3B).鋅鰲合劑CQ能減緩高鋅對APP/PSI轉基因鼠的毒害作用，但其自身對APP/PSl轉荃因鼠的毛色，體重沒有影響(圖3A，B)。各組小鼠行為學檢測完后，通過原子吸收光譜法我們進一步檢測了血清鋅和腦鋅含量的變化。高鋅喂養(yǎng)組小鼠血清鋅和腦鋅含量均遠遠高于其它三組小鼠血清鋅和腦鋅含量(凡0.01)(圖3C，D)，cQ能降低飲食中高鋅致使轉基因鼠血清鋅和腦鋅含量的增加，但是其本身卻對轉基因鼠血清鋅和腦鋅含量沒有影響(圖3C，，D)。

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本文編號：2643453