發(fā)布時(shí)間：2020-04-28 02:29

【摘要】：阿爾茨海默病(alzheimer's disease, AD)是以進(jìn)行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的大腦變性疾病,是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)：全球約有2千多萬(wàn)AD病人,并正以每年460萬(wàn)人的速度增加。AD嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān),是各國(guó)面臨或?qū)⒁媾R的重要衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。現(xiàn)有的研究表明,Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD發(fā)病過(guò)程中起到重要作用,但是令人遺憾的是,以上述幾個(gè)方面做為靶點(diǎn)的治療未能取得令人滿(mǎn)意的效果。因此,從新的角度研究AD的發(fā)病機(jī)理及探尋新的治療方法是非常有必要的。MicroRNAs (miRNAs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約18-25nt小調(diào)節(jié)RNAs,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA在腦組織中含量豐富,并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞分化及突觸的可塑性方面發(fā)揮重要作用。目前,越來(lái)越多的研究表明miRNAs的功能異常可能參與了AD的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),1niR-107、miR-29a/b、miR-298和miR-328均可通過(guò)BACE1調(diào)控AD的發(fā)生發(fā)展。但是,miRNAs在AD中的作用機(jī)制的研究仍處于起步階段。 TGF-βs,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,是一種多功能的細(xì)胞因子家族,擁有非常重要的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。TGFBR2是一種高親和力的TGF-β的跨膜受體蛋白,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。TGF-ps與TGFBR2結(jié)合,引起TGFBR2與TGFBR1構(gòu)成異二聚體復(fù)合物,引發(fā)細(xì)胞內(nèi)受體激活型Smad2和Smad3的磷酸化,磷酸化的Smad2和Smad3通過(guò)與協(xié)同型Smad4結(jié)合,將TGF-β的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控靶基因的表達(dá)。Smad6和Smad7屬于抑制型Smad,其表達(dá)與TGF-β信號(hào)通路的活性呈負(fù)相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道,TGF-β1在AD病人的腦組織和腦脊液中表達(dá)升高,在血漿中表達(dá)降低,TGFBR2在AD患者的腦組織中的表達(dá)降低。 本課題為了探討miRNAs在AD發(fā)生發(fā)展中的作用,以APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠研究對(duì)象,用miRNAs芯片和熒光定量PCR的方法檢測(cè)其miRNAs的表達(dá)與正常小鼠之間的差別,發(fā)現(xiàn)miR-106b在3月齡和6月齡AD模型小鼠中表達(dá)升高,9月齡AD模型小鼠中表達(dá)降低。通過(guò)(?)argetScan、Pictar和miRanda等miRNAs靶基因預(yù)測(cè)方法對(duì)miR-106b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)TGFBR2 3'UTR與miR-106b之間有2個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)。在miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)TGFBR2的蛋白表達(dá)降低,但其mRNA水平無(wú)明顯變化；用miR-106b反義寡核苷酸LAN探針來(lái)抑制miR-106b的表達(dá),發(fā)現(xiàn)抑制miR-106b的表達(dá)后,TGFBR2的表達(dá)升高,其mRNA水平無(wú)明顯改變,這一結(jié)果提示miR-106b可能作用于TGFBR2。為了證明TGFBR2 3'UTR序列包含miR-106b作用的位點(diǎn),將TGFBR2 3'UTR序列克隆至螢光素酶報(bào)告載體中,并與miR-106b表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至293T和CHO細(xì)胞中,然后檢測(cè)螢光素酶的活性,結(jié)果表明miR-106b的過(guò)表達(dá)可以明顯抑制抑制螢光素酶的活性；將TGFBR2 3'UTR-螢光素酶報(bào)告載體中miR-106b可能的結(jié)合位點(diǎn)采用定點(diǎn)突變的方法突變以后,再和miR-106b表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞和CHO細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比,結(jié)合位點(diǎn)1突變后,螢光素酶的活性?xún)H發(fā)生微弱的變化,結(jié)合位點(diǎn)2突變后,熒光素酶的活性仍明顯降低,將這兩個(gè)與miR-106b結(jié)合位點(diǎn)都突變后,熒光素酶的活性與僅突變結(jié)合位點(diǎn)1相同僅發(fā)生微弱變化,兩種細(xì)胞中的結(jié)果一致,這說(shuō)明miR-106b可以通過(guò)與TGFBR2 3'UTR的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)1直接結(jié)合調(diào)節(jié)TGFBR2蛋白的表達(dá)。為了觀察miR-106b對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的影響,用維甲酸誘導(dǎo)miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞變圓、貼壁不好、懸浮、崩解等退行性改變。進(jìn)一步檢測(cè)Smads蛋白的表達(dá),在miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中,總的Smad2/3的表達(dá)沒(méi)有改變,而活化的pSmad2/3的表達(dá)降低；抑制型Smad6/7的表達(dá)升高。此外,用Aβ42寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞,Aβ42寡聚體誘導(dǎo)12h、24h、36h時(shí)后,miR-106b的表達(dá)升高,Aβ42寡聚體誘導(dǎo)48h時(shí)后,miR-106b的表達(dá)降低,表明Aβ42寡聚體可以對(duì)(?)miR-106b的表達(dá)產(chǎn)生影響。上述在體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Aβ42寡聚體誘導(dǎo)miR-106b表達(dá)異常,miR-106b可能通過(guò)調(diào)控TGFBR2的表達(dá)影響Smads蛋白的表達(dá),從而影響TGF-β信號(hào)通路的活性引起了細(xì)胞的退行性改變。 對(duì)AD模型小鼠體內(nèi)的TGFBR2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)TGFBR2蛋白在AD模型小鼠體內(nèi)表達(dá)降低。此外,為了更好的在體內(nèi)研究miR-106b的調(diào)控作用,成功構(gòu)建了miR-106b轉(zhuǎn)基因小鼠。用western blot檢測(cè)TGFBR2蛋白的表達(dá),與同齡對(duì)照相比,miR-106b轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織TGFBR2蛋白的表達(dá)升高。 總之,本課題通過(guò)在體外細(xì)胞水平及模型小鼠體內(nèi)證實(shí)了TGFBR2是miR-106b一種非常重要的靶基因,miR-106b可能通過(guò)調(diào)控TGFBR2影響了TGF-β信號(hào)通路的活性,從而參與AD的發(fā)病,為AD的治療提供了新的思路。
【圖文】：

加工及調(diào)控機(jī)制。miRNA基因由RNA聚合酶A印ri一miRNA)分子。然后核糖核酸酶Drosha，剪切pri一到細(xì)胞漿，由Dicer加工生成成熟的miRNA。成熟的miR復(fù)合體結(jié)合，然后與mRNA的3’非翻譯端結(jié)合抑制mRNAs作為基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控因子，通過(guò)抑制靶基因mRNA揮作用。在植物中miRNAS通常通過(guò)堿基完全匹配引發(fā)靶中miRNAS通常通過(guò)堿基的不完全匹配抑制靶mRNAS的明一個(gè)miRNAs可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶mRNAs，同時(shí)，一個(gè)NAS調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)翻譯調(diào)控的瞬時(shí)特異性腳l。在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)iRNAs在各組織中廣泛表達(dá)，有的miRNAS僅在某些特定的增高。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)了大量的神經(jīng)特異性或在神經(jīng)組織中富集織中均表達(dá)的miRNAs稱(chēng)為CNS一特異性的miRNAs，包括

17rePresentedPositivetransgenieIniee.2.RNA質(zhì)量的鑒定提取的總RNA在0.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1一6。從圖中我們可以看到285和185條帶清晰明亮，55條帶較弱，，這說(shuō)明又NA無(wú)明顯降解。此外，我們?cè)谧贤夥止夤舛扔?jì)上測(cè)定A260/280，其比值均在 1.8~2.0，說(shuō)明RNA純度較好。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2642952