【摘要】：阿爾茨海默病(alzheimer's disease, AD)是以進行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的大腦變性疾病,是導(dǎo)致老年人癡呆的主要原因。據(jù)統(tǒng)計：全球約有2千多萬AD病人,并正以每年460萬人的速度增加。AD嚴重影響老年人的生活質(zhì)量,給家庭和社會帶來沉重的負擔,是各國面臨或?qū)⒁媾R的重要衛(wèi)生和社會經(jīng)濟問題。現(xiàn)有的研究表明,Aβ、Tau、PS和ApoE等均在AD發(fā)病過程中起到重要作用,但是令人遺憾的是,以上述幾個方面做為靶點的治療未能取得令人滿意的效果。因此,從新的角度研究AD的發(fā)病機理及探尋新的治療方法是非常有必要的。MicroRNAs (miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的長約18-25nt小調(diào)節(jié)RNAs,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。miRNA在腦組織中含量豐富,并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)細胞分化及突觸的可塑性方面發(fā)揮重要作用。目前,越來越多的研究表明miRNAs的功能異�？赡軈⑴c了AD的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),1niR-107、miR-29a/b、miR-298和miR-328均可通過BACE1調(diào)控AD的發(fā)生發(fā)展。但是,miRNAs在AD中的作用機制的研究仍處于起步階段。 TGF-βs,包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,是一種多功能的細胞因子家族,擁有非常重要的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)作用。TGFBR2是一種高親和力的TGF-β的跨膜受體蛋白,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。TGF-ps與TGFBR2結(jié)合,引起TGFBR2與TGFBR1構(gòu)成異二聚體復(fù)合物,引發(fā)細胞內(nèi)受體激活型Smad2和Smad3的磷酸化,磷酸化的Smad2和Smad3通過與協(xié)同型Smad4結(jié)合,將TGF-β的信號傳遞到細胞核內(nèi),調(diào)控靶基因的表達。Smad6和Smad7屬于抑制型Smad,其表達與TGF-β信號通路的活性呈負相關(guān)。文獻報道,TGF-β1在AD病人的腦組織和腦脊液中表達升高,在血漿中表達降低,TGFBR2在AD患者的腦組織中的表達降低。 本課題為了探討miRNAs在AD發(fā)生發(fā)展中的作用,以APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠研究對象,用miRNAs芯片和熒光定量PCR的方法檢測其miRNAs的表達與正常小鼠之間的差別,發(fā)現(xiàn)miR-106b在3月齡和6月齡AD模型小鼠中表達升高,9月齡AD模型小鼠中表達降低。通過(?)argetScan、Pictar和miRanda等miRNAs靶基因預(yù)測方法對miR-106b的靶基因進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)TGFBR2 3'UTR與miR-106b之間有2個預(yù)測結(jié)合位點。在miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中,發(fā)現(xiàn)TGFBR2的蛋白表達降低,但其mRNA水平無明顯變化；用miR-106b反義寡核苷酸LAN探針來抑制miR-106b的表達,發(fā)現(xiàn)抑制miR-106b的表達后,TGFBR2的表達升高,其mRNA水平無明顯改變,這一結(jié)果提示miR-106b可能作用于TGFBR2。為了證明TGFBR2 3'UTR序列包含miR-106b作用的位點,將TGFBR2 3'UTR序列克隆至螢光素酶報告載體中,并與miR-106b表達載體共轉(zhuǎn)染至293T和CHO細胞中,然后檢測螢光素酶的活性,結(jié)果表明miR-106b的過表達可以明顯抑制抑制螢光素酶的活性；將TGFBR2 3'UTR-螢光素酶報告載體中miR-106b可能的結(jié)合位點采用定點突變的方法突變以后,再和miR-106b表達載體共轉(zhuǎn)染至293T細胞和CHO細胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照相比,結(jié)合位點1突變后,螢光素酶的活性僅發(fā)生微弱的變化,結(jié)合位點2突變后,熒光素酶的活性仍明顯降低,將這兩個與miR-106b結(jié)合位點都突變后,熒光素酶的活性與僅突變結(jié)合位點1相同僅發(fā)生微弱變化,兩種細胞中的結(jié)果一致,這說明miR-106b可以通過與TGFBR2 3'UTR的預(yù)測結(jié)合位點1直接結(jié)合調(diào)節(jié)TGFBR2蛋白的表達。為了觀察miR-106b對神經(jīng)細胞生長和分化的影響,用維甲酸誘導(dǎo)miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,發(fā)現(xiàn)與對照相比miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的細胞變圓、貼壁不好、懸浮、崩解等退行性改變。進一步檢測Smads蛋白的表達,在miR-106b穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中,總的Smad2/3的表達沒有改變,而活化的pSmad2/3的表達降低；抑制型Smad6/7的表達升高。此外,用Aβ42寡聚體誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞,Aβ42寡聚體誘導(dǎo)12h、24h、36h時后,miR-106b的表達升高,Aβ42寡聚體誘導(dǎo)48h時后,miR-106b的表達降低,表明Aβ42寡聚體可以對(?)miR-106b的表達產(chǎn)生影響。上述在體外的實驗結(jié)果提示Aβ42寡聚體誘導(dǎo)miR-106b表達異常,miR-106b可能通過調(diào)控TGFBR2的表達影響Smads蛋白的表達,從而影響TGF-β信號通路的活性引起了細胞的退行性改變。 對AD模型小鼠體內(nèi)的TGFBR2蛋白的表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)TGFBR2蛋白在AD模型小鼠體內(nèi)表達降低。此外,為了更好的在體內(nèi)研究miR-106b的調(diào)控作用,成功構(gòu)建了miR-106b轉(zhuǎn)基因小鼠。用western blot檢測TGFBR2蛋白的表達,與同齡對照相比,miR-106b轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織TGFBR2蛋白的表達升高。 總之,本課題通過在體外細胞水平及模型小鼠體內(nèi)證實了TGFBR2是miR-106b一種非常重要的靶基因,miR-106b可能通過調(diào)控TGFBR2影響了TGF-β信號通路的活性,從而參與AD的發(fā)病,為AD的治療提供了新的思路。
【圖文】：

加工及調(diào)控機制。miRNA基因由RNA聚合酶A印ri一miRNA)分子。然后核糖核酸酶Drosha，剪切pri一到細胞漿，由Dicer加工生成成熟的miRNA。成熟的miR復(fù)合體結(jié)合，然后與mRNA的3’非翻譯端結(jié)合抑制mRNAs作為基因表達的負性調(diào)控因子，通過抑制靶基因mRNA揮作用。在植物中miRNAS通常通過堿基完全匹配引發(fā)靶中miRNAS通常通過堿基的不完全匹配抑制靶mRNAS的明一個miRNAs可以同時調(diào)控多個靶mRNAs，同時，一個NAS調(diào)控，從而實現(xiàn)翻譯調(diào)控的瞬時特異性腳l。在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達iRNAs在各組織中廣泛表達，有的miRNAS僅在某些特定的增高。近年來發(fā)現(xiàn)了大量的神經(jīng)特異性或在神經(jīng)組織中富集織中均表達的miRNAs稱為CNS一特異性的miRNAs，包括

17rePresentedPositivetransgenieIniee.2.RNA質(zhì)量的鑒定提取的總RNA在0.7%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)果見圖1一6。從圖中我們可以看到285和185條帶清晰明亮，55條帶較弱，，這說明又NA無明顯降解。此外，我們在紫外分光光度計上測定A260/280，其比值均在 1.8~2.0，說明RNA純度較好。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R749.16

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本文編號：2642952