【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是以漸進(jìn)性認(rèn)知能力損害和記憶功能障礙為主要表現(xiàn),并且與年齡密切相關(guān)的一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其兩大重要的病理學(xué)改變是神經(jīng)細(xì)胞間聚集的大量老年斑(senile plaques,SP)和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)。老年斑主要由淀粉樣多肽-b(amyloid-b,Ab)構(gòu)成,而神經(jīng)原纖維纏結(jié)的核心成分是由異常過(guò)度磷酸化的tau構(gòu)成。目前,由于缺乏早期非侵入性生物標(biāo)志物,AD尚不能早期確診。AD患者的視覺(jué)功能障礙是普遍存在的,其患者的視網(wǎng)膜和大腦中發(fā)現(xiàn)的組織病理學(xué)改變也是非常相似的,并且與認(rèn)知和行為缺陷的嚴(yán)重程度緊密相關(guān),更重要的是眼球中視網(wǎng)膜的改變可以被非侵入性的手段檢測(cè)到。流行病學(xué)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥是AD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因素。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)給大鼠尾靜脈注射同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)14天可以造成大鼠出現(xiàn)AD樣學(xué)習(xí)記憶功能障礙以及AD樣病理改變,同時(shí)給予葉酸及維生素B12后,可以逆轉(zhuǎn)AD樣病變并且改善學(xué)習(xí)記憶功能。在本研究中,給予大鼠尾靜脈漸進(jìn)性地注射Hcy或同時(shí)輔飼葉酸和維生素B12進(jìn)行治療,以此研究高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,Hhcy)是否引起大鼠眼睛出現(xiàn)AD樣病理改變從而探討眼睛能否作為早期診斷和評(píng)價(jià)治療的窗口。主要研究結(jié)果如下:第一部分視網(wǎng)膜pS262-tau和DM-PP2A作為高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)阿爾茨海默病的早期標(biāo)志分子采用健康的成年雄性SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,通過(guò)尾靜脈注射不同時(shí)間的Hcy,同時(shí)觀察眼球和海馬的病理改變,來(lái)研究大鼠眼球是否會(huì)出現(xiàn)并早于海馬的AD樣病變。具體的方法和結(jié)果如下:一、血液中逐漸升高的Hcy對(duì)大鼠記憶和突觸功能的影響為了研究逐漸升高的Hcy對(duì)大鼠記憶功能的影響,大鼠尾靜脈注射Hcy 400μg/kg/day 3、7和14天,結(jié)果顯示:大鼠血漿中的Hcy水平隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,并且在注射后14天出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥(Hhcy)。然后,通過(guò)新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)大鼠的記憶功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠只有在注射Hcy 14天后才會(huì)出現(xiàn)記憶功能障礙,同時(shí)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OFT)結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)注射Hcy并不會(huì)引起大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙以及焦慮行為。進(jìn)一步檢測(cè)了Hcy的逐漸升高對(duì)突觸功能的影響,用抗體syanpsin-1和PSD-95進(jìn)行Western blotting檢測(cè),結(jié)果顯示注射Hcy 14天后大鼠的突觸蛋白出現(xiàn)明顯的降低;長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)檢測(cè)結(jié)果表明注射Hcy 14天后的大鼠才會(huì)引起突觸可塑性的降低。這些結(jié)果說(shuō)明大鼠只有在尾靜脈注射Hcy 14天后才會(huì)出現(xiàn)可檢測(cè)的記憶功能障礙。二、血液中逐漸升高的Hcy對(duì)眼球的影響由于視網(wǎng)膜是大腦神經(jīng)的延續(xù),并且和大腦有著相似的神經(jīng)傳遞系統(tǒng)。并且有大量的研究報(bào)告顯示在AD患者的視網(wǎng)膜中出現(xiàn)了相關(guān)的病理改變。為了研究視網(wǎng)膜是否會(huì)出現(xiàn)和海馬類似的AD樣病變,首先通過(guò)眼底照相檢測(cè)了Hcy注射不同時(shí)間點(diǎn)后各組大鼠的眼底改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠視網(wǎng)膜面均光滑平整,無(wú)明顯出血及滲出,僅在注射14天后視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)了血管迂曲及管徑狹窄的改變。視網(wǎng)膜的HE(Hematoxylin-eosin,HE)染色結(jié)果顯示各組的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)層次清晰,厚度無(wú)明顯差異。但是注射Hcy 14天后,大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(ganglion cell layer,GCL)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell,RGC)出現(xiàn)了空泡化以及核染色質(zhì)聚集的改變,同時(shí)伴有非常明顯的RGC數(shù)目的減少。雖然內(nèi)核細(xì)胞層(inner nuclear layer,INL)的細(xì)胞數(shù)目有下降的趨勢(shì),但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上卻無(wú)明顯差異。光學(xué)相干斷層掃描技術(shù)(optical coherence tomography,OCT)對(duì)各組大鼠的視網(wǎng)膜檢測(cè)結(jié)果顯示各組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次清晰,無(wú)異常隆起或滲出,視網(wǎng)膜厚度無(wú)明顯改變。這些結(jié)果顯示尾靜脈注射Hcy 14天后,隨著大鼠血漿內(nèi)Hcy的水平增加,視網(wǎng)膜會(huì)出現(xiàn)血管狹窄迂曲,RGC形態(tài)改變以及數(shù)目減少這種與AD時(shí)海馬區(qū)相似的神經(jīng)退行性改變。同時(shí)檢測(cè)了眼球的其他組織(角膜、晶狀體),探究其在注射Hcy 14天后是否也會(huì)發(fā)生相關(guān)的AD樣病理學(xué)改變。ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)檢測(cè)眼球不同組織(角膜、晶狀體和視網(wǎng)膜)中的Ab42的含量,發(fā)現(xiàn)注射Hcy 14天后,Ab42的含量?jī)H在視網(wǎng)膜中增高,在角膜和晶狀體中并無(wú)明顯改變。Western blotting檢測(cè)三種組織中總tau(Tau-5)、去磷酸化tau(Tau-1)和tau蛋白在Ser396位點(diǎn)的磷酸化(PS396),結(jié)果顯示三種組織中的Tau-5沒(méi)有明顯改變,但是注射Hcy 14天后,只有視網(wǎng)膜中的Tau-1出現(xiàn)明顯降低并且tau蛋白在Ser396位點(diǎn)出現(xiàn)過(guò)度磷酸化。這些結(jié)果提示大鼠體內(nèi)Hcy的水平增加,并不會(huì)影響角膜及晶狀體組織,只有視網(wǎng)膜組織會(huì)受其影響出現(xiàn)與AD相關(guān)的神經(jīng)退行性病理改變。因此,我們選擇視網(wǎng)膜作為AD的早期診斷窗口。三、Hhcy發(fā)展過(guò)程中視網(wǎng)膜pS262-tau水平升高比Ab早,且早于海馬組織的tau病變?yōu)榱诉M(jìn)一步探討在Hcy誘導(dǎo)的AD模型大鼠中,視網(wǎng)膜中是否出現(xiàn)比海馬更早的病變指標(biāo),我們首先檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)兩種組織的Ab病變。用ELISA檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中的Ab42的含量,發(fā)現(xiàn)Ab42的含量在視網(wǎng)膜和海馬中均在注射Hcy 14天后才有明顯的增高;用6E10的抗體對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色顯示,注射Hcy 7天后,視網(wǎng)膜的GCL和INL中才開始出現(xiàn)陽(yáng)性著色;而注射Hcy 3天后,海馬6E10的免疫組化染色就開始出現(xiàn)陽(yáng)性著色;Western blotting檢測(cè)不同注射時(shí)間時(shí)各組大鼠視網(wǎng)膜的APP、PS1和BACE1含量顯示,PS1在注射7后開始升高,而APP和BACE1在注射14天后才有明顯增高。用Western blotting檢測(cè)不同注射時(shí)間點(diǎn)各組大鼠視網(wǎng)膜和海馬組織的tau蛋白在Ser262、Ser356、Ser396、Ser214、Ser422和Thr212位點(diǎn)的磷酸化(PS262、PS356、PS396、PS214、PS422和PT212),結(jié)果顯示視網(wǎng)膜的PS262在注射3天后就開始出現(xiàn)明顯增高,而海馬在注射14天后才出現(xiàn)PS262的增高。余位點(diǎn)在兩種組織中沒(méi)有明顯的差異。用PS262的抗體對(duì)各組視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色顯示,與Western blotting檢測(cè)結(jié)果一致,注射Hcy 3天后,視網(wǎng)膜的GCL和INL中就開始出現(xiàn)PS262的增高。而海馬的PS262免疫組化染色顯示,在注射14天后才出現(xiàn)陽(yáng)性著色。這些結(jié)果說(shuō)明Hhcy模型中,大鼠視網(wǎng)膜中pS262-tau的增高明顯早于海馬中的病變,提示pS262-tau可作為一個(gè)早期診斷AD的生物學(xué)指標(biāo)。四、Hhcy升高過(guò)程中視網(wǎng)膜甲基化和去甲基化PP2Ac的病理改變明顯早于海馬組織蛋白激酶的激活或者是蛋白磷酸酯酶的抑制是造成Tau蛋白過(guò)度磷酸化的直接原因,而在各種激酶和磷酸酯酶中,GSK-3β和PP2A又是與之聯(lián)系最緊密的。因此,通過(guò)Western blotting檢測(cè)不同注射時(shí)間點(diǎn)各組大鼠視網(wǎng)膜和海馬組織的GSK-3β、GSK-3β在Ser-9位點(diǎn)的磷酸化(GSK-3β-S9)、PP2Ac、甲基化的PP2Ac(M-PP2Ac)和去甲基化的PP2Ac(DM-PP2Ac)的含量,結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高明顯早于海馬組織。余蛋白在兩種組織中的表達(dá)并無(wú)明顯差異。用去甲基化的PP2Ac的抗體對(duì)各組視網(wǎng)膜進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色顯示,與Western blotting檢測(cè)結(jié)果一致,注射Hcy 3天后,視網(wǎng)膜的GCL和INL中就開始出現(xiàn)去甲基化的PP2Ac的增高。而海馬的PS262免疫組化染色顯示,在注射14天后才出現(xiàn)陽(yáng)性著色。這些結(jié)果說(shuō)明Hhcy模型中,大鼠視網(wǎng)膜中甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高明顯早于海馬中的病變,提示甲基化的PP2Ac的降低和去甲基化的PP2Ac的升高也可以作為一個(gè)早期診斷AD的生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)論Hhcy可引起視網(wǎng)膜發(fā)生AD相關(guān)病變,其中pS262-tau和DM-PP2Ac增高、M-PP2Ac降低可望成為AD早期診斷指標(biāo)。第二部分視網(wǎng)膜可作為高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)阿爾茨海默病治療效果評(píng)價(jià)的潛在窗口通過(guò)對(duì)成年SD大鼠進(jìn)行尾靜脈注射同型半胱氨酸14天,模擬高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的AD樣病變,同時(shí)給予葉酸及維生素B12,探討能否通過(guò)視網(wǎng)膜評(píng)價(jià)AD治療的有效性。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:一、葉酸和維生素B12對(duì)Hhcy誘導(dǎo)的AD模型大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)的影響為研究能否通過(guò)視網(wǎng)膜來(lái)評(píng)價(jià)AD治療的有效性,我們采用成年SD大鼠,通過(guò)尾靜脈注射Hcy(400μg/kg/day)14天復(fù)制高同型半胱氨酸血癥(Hhcy),或同時(shí)輔飼葉酸及維生素B12治療。結(jié)果顯示,葉酸及維生素B12能夠降低血漿中的Hcy含量。同時(shí)視網(wǎng)膜眼底照相檢查結(jié)果顯示葉酸及維生素B12也能夠逆轉(zhuǎn)Hcy造成的視網(wǎng)膜血管迂曲變窄的病理現(xiàn)象。二、葉酸和維生素B12對(duì)視網(wǎng)膜中Ab的影響用ELISA檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中的Ab42的含量,發(fā)現(xiàn)葉酸及維生素B12能夠降低Hcy引起的Ab42含量的增高;三組視網(wǎng)膜6E10的免疫組化和免疫熒光染色也得出了同樣的結(jié)果;Western blotting檢測(cè)了與Ab生成相關(guān)的APP、PS1和BACE1三種蛋白的含量,結(jié)果顯示補(bǔ)充葉酸及維生素B12能夠降低Hcy引起的其含量的增高。這些結(jié)果說(shuō)明了葉酸和維生素B12能夠降低視網(wǎng)膜中由Hcy引起的Ab聚集增高。三、葉酸和維生素B12對(duì)視網(wǎng)膜中tau蛋白磷酸化的影響用Western blotting檢測(cè)三組動(dòng)物視網(wǎng)膜組織中tau蛋白Tau-1、PS262和PS356位點(diǎn)磷酸化水平的改變。結(jié)果顯示,葉酸及維生素B12能夠逆轉(zhuǎn)Hcy所引起的tau蛋白病變,視網(wǎng)膜p S262-tau蛋白的免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果與上述結(jié)果一致。四、葉酸和維生素B12對(duì)視網(wǎng)膜中蛋白激酶和磷酸酯酶的影響進(jìn)一步檢測(cè)了視網(wǎng)膜中蛋白激酶和磷酸酯酶的變化,用Western blotting檢測(cè)三組動(dòng)物視網(wǎng)膜組織中GSK-3β、GSK-3β-S9、PP2Ac、甲基化的PP2Ac和去甲基化的P P2Ac,結(jié)果顯示葉酸及維生素B12能夠恢復(fù)Hcy所引起的蛋白激酶和磷酸酯酶的異常改變。視網(wǎng)膜去甲基化的PP2Ac的免疫組化和免疫熒光染色結(jié)果與上述結(jié)果一致。結(jié)論葉酸及維生素B12治療可逆轉(zhuǎn)Hhcy誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜AD樣病變,提示可通過(guò)視網(wǎng)膜來(lái)評(píng)價(jià)AD藥物治療的有效性。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2617569